समाचार

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
सक्रिय एस्टर वा फेनोक्सी रेडिकलहरूमा आधारित एन्जाइमेटिक निकटता लेबलिंग विधिहरू जीवित कोशिकाहरूमा सबसेलुलर प्रोटोमहरू र प्रोटीन अन्तरक्रियाकर्ताहरू नक्सा गर्न व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ।यद्यपि, सक्रिय एस्टरहरू कम प्रतिक्रियाशील हुन्छन्, फलस्वरूप फराकिलो लेबलिङ त्रिज्या हुन्छ, र पेरोक्साइड उपचारद्वारा उत्पन्न हुने फेनोक्सी रेडिकलहरूले रेडक्स मार्गहरूमा हस्तक्षेप गर्न सक्छन्।यहाँ हामी miniSOG फोटोसेन्सिटाइजर प्रोटीनलाई रुचिको प्रोटिनमा आनुवंशिक रूपमा लिङ्क गरेर विकसित गरिएको निकटता लेबलिङ निर्भर फोटोएक्टिभेसन (PDPL) विधि रिपोर्ट गर्छौं।नीलो प्रकाश द्वारा ट्रिगर गरिएको र एक्सपोजर समय द्वारा नियन्त्रित, सिंगल अक्सिजन उत्पन्न हुन्छ र त्यसपछि एनिलिन प्रोब द्वारा हिस्टिडाइन अवशेषहरूको स्प्याटियोटेम्पोरली समाधान गरिएको लेबलिंग हासिल गरिन्छ।हामी organelle-विशिष्ट प्रोटोम म्यापिङ मार्फत यसको उच्च निष्ठा प्रदर्शन गर्छौं।टर्बोआईडीसँग PDPL को छेउछाउको तुलनाले PDPL को थप विशिष्ट र व्यापक प्रोटोमिक कभरेज देखाउँछ।अर्को, हामीले PDPL लाई रोग-सम्बन्धित ट्रान्सक्रिप्शनल कोएक्टिभेटर BRD4 र E3 Parkin ligase मा लागू गर्यौं र पहिले अज्ञात अन्तरक्रियाकर्ताहरू फेला पार्यौं।ओभरएक्सप्रेसन स्क्रिनिङद्वारा, दुई अज्ञात सब्सट्रेटहरू, Ssu72 र SNW1, पार्किनका लागि पहिचान गरियो, जसको पतन सर्वव्यापी-प्रोटीसोम मार्गद्वारा मध्यस्थता हो।
प्रोटीन सञ्जालहरूको सही विशेषताले धेरै आधारभूत सेलुलर प्रक्रियाहरूलाई निहित गर्दछ।तसर्थ, प्रोटीन अन्तरक्रियाहरूको अत्यधिक सटीक स्प्याटियोटेम्पोरल म्यापिङले जैविक मार्गहरू, रोग रोगविज्ञान, र चिकित्सकीय उद्देश्यका लागि यी अन्तरक्रियाहरूलाई बाधा पुर्‍याउनको लागि आणविक आधार प्रदान गर्नेछ।यस अन्तको लागि, जीवित कोशिकाहरू वा तन्तुहरूमा अस्थायी अन्तरक्रियाहरू पत्ता लगाउन सक्षम विधिहरू अत्यधिक वांछनीय छन्।एफिनिटी प्युरिफिकेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (AP-MS) ऐतिहासिक रूपमा रूचिको प्रोटीन (POIs) को बाध्यकारी साझेदारहरू पहिचान गर्न प्रयोग गरिएको छ।मात्रात्मक प्रोटोमिक्स विधिहरूको विकासको साथ, Bioplex3.0 सिर्जना गरिएको थियो, AP-MS मा आधारित प्रोटीन नेटवर्कहरूको सबैभन्दा ठूलो डाटाबेस।यद्यपि AP-MS धेरै शक्तिशाली छ, कार्यप्रवाहमा सेल lysis र dilution चरणहरू कमजोर र क्षणिक बाध्यकारी अन्तरक्रियाहरू तिर पूर्वाग्रही छन् र पोस्ट-lysis कलाकृतिहरू परिचय दिन्छ जस्तै नकली अन्तरक्रिया जोडीहरू जसमा lysis अघि compartmentalization को कमी छ।
यी समस्याहरूलाई सम्बोधन गर्न, क्रसलिङ्किङ समूहहरू सहितको अप्राकृतिक एमिनो एसिड (UAA) र इन्जाइम्याटिक नजिकैको लेबलिङ (PL) प्लेटफर्महरू (जस्तै APEX र BioID) 5 विकास गरिएको छ।यद्यपि UAA विधि सफलतापूर्वक धेरै परिदृश्यहरूमा लागू गरिएको छ र प्रत्यक्ष प्रोटीन चिपकने मा जानकारी प्रदान गर्दछ, UAA सम्मिलन साइट को अनुकूलन अझै आवश्यक छ।अझ महत्त्वपूर्ण कुरा, यो एक स्टोइचियोमेट्रिक लेबलिङ विधि हो जसमा लेबलिङ घटनाहरूको उत्प्रेरक रिभर्सलको कमी छ।यसको विपरित, बायोआईडी विधि जस्ता इन्जाइमेटिक पीएल विधिहरूले इन्जिनियर गरिएको बायोटिन लिगेसलाई POI7 मा फ्यूज गर्दछ, जसले पछि प्रतिक्रियाशील बायोटिनिल-एएमपी एस्टर मध्यवर्ती बनाउन बायोटिन सक्रिय गर्दछ।इन्जाइमले यसरी उत्प्रेरित गर्दछ र सक्रिय बायोटिन "क्लाउड" जारी गर्दछ जसले निकटतम लाइसिन अवशेषहरूलाई लेबल गर्दछ।यद्यपि, BioID लाई पर्याप्त लेबल गरिएको संकेत प्राप्त गर्न १२ घण्टा भन्दा बढी आवश्यक पर्दछ, जसले अस्थायी रिजोल्युसनको साथ यसको प्रयोगलाई रोक्छ।खमीर डिस्प्लेमा आधारित निर्देशित इभोलुसन प्रयोग गर्दै, टर्बोआईडीलाई BioID को आधारमा अधिक प्रभावकारी बनाउन डिजाइन गरिएको थियो, 10 मिनेट भित्र बायोटिनको साथ कुशल लेबलिङलाई अनुमति दिँदै, थप गतिशील प्रक्रियाहरू अध्ययन गर्न अनुमति दिँदै।किनभने टर्बोआईडी अत्यधिक सक्रिय छ र अन्तर्जात बायोटिन स्तरहरू निम्न-स्तर लेबलिङका लागि पर्याप्त छन्, पृष्ठभूमि लेबलिङ एक सम्भावित समस्या बन्न सक्छ जब अत्यधिक परिष्कृत र समयबद्ध लेबलिंग exogenous बायोटिन थपेर आवश्यक हुन्छ।थप रूपमा, सक्रिय एस्टरहरू कमजोर प्रतिक्रियाशील हुन्छन् (t1/2 ~ 5 मिनेट), जसले ठूलो लेबलिङ त्रिज्या निम्त्याउन सक्छ, विशेष गरी बायोटिन 5 सँग छिमेकी प्रोटीनहरूको संतृप्ति पछि। अर्को दृष्टिकोणमा, ईन्जिनियर गरिएको एस्कर्बेट पेरोक्सिडेजको आनुवंशिक फ्यूजन (जस्तै बायोटिन- फिनोल रेडिकलहरू र एक मिनेट 9,10 भित्र प्रोटीन लेबलिंग गर्न अनुमति दिन्छ। APEX व्यापक रूपमा सबसेलुलर प्रोटोमहरू, झिल्ली प्रोटीन कम्प्लेक्सहरू, र साइटोसोलिक सिग्नलिंग प्रोटीन कम्प्लेक्सहरू 11,12 पहिचान गर्न प्रयोग गरिन्छ। यद्यपि, पेरोक्साइडको उच्च सांद्रताको आवश्यकताले रेडक्स प्रोटीन वा मार्गहरूलाई असर गर्न सक्छ। सेलुलर प्रक्रियाहरू।
यसरी, सेलुलर मार्गहरूमा उल्लेखनीय रूपमा अवरोध नगरी उच्च स्थानिय र अस्थायी शुद्धताका साथ थप प्रतिक्रियाशील लेबल-त्रिज्य दमन प्रजातिहरू उत्पन्न गर्न सक्षम नयाँ विधि अवस्थित विधिहरूमा महत्त्वपूर्ण थप हुनेछ। प्रतिक्रियाशील प्रजातिहरू मध्ये, सिंगल अक्सिजनले यसको छोटो जीवनकाल र सीमित फैलावट त्रिज्या (t1/2 <0.6 µs कक्षहरूमा) 13 को कारणले हाम्रो ध्यान जगायो। प्रतिक्रियाशील प्रजातिहरू मध्ये, सिंगल अक्सिजनले यसको छोटो जीवनकाल र सीमित फैलावट त्रिज्या (t1/2 <0.6 µs कक्षहरूमा) 13 को कारणले हाम्रो ध्यान जगायो। Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного ограниченного , ограниченного и ограниченного и ограниченного. सक्रिय रूपहरू मध्ये, सिंगल अक्सिजनले यसको छोटो जीवनकाल र सीमित प्रसार त्रिज्या (कोषहरूमा t1/2 <0.6 µs) 13 को कारणले हाम्रो ध्यान आकर्षित गर्‍यो।在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 的 0.6 µs）耵耬. १/२ < ०.६ µs）而引起了我们的注意१३ Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни , времени жизни , и ограниченноговкает/ सक्रिय रूपहरू मध्ये, सिंगल अक्सिजनले हाम्रो ध्यान आकर्षित गर्छ किनभने यसको छोटो जीवनकाल र सीमित प्रसार त्रिज्या (t1/2 <0.6 μs कक्षहरूमा)।एकल अक्सिजनले अनियमित रूपमा मेथियोनाइन, टाइरोसिन, हिस्टिडाइन र ट्रिप्टोफ्यानलाई अक्सिडाइज गर्ने रिपोर्ट गरिएको छ, जसले यसलाई ध्रुवीय 14,15 बनाउँछ अमाइन वा थायोलमा आधारित प्रोबहरू 16,17 मा संलग्न गर्नका लागि।यद्यपि सिंगलट अक्सिजनलाई सबसेलुलर कम्पार्टमेन्ट आरएनए लेबल गर्न प्रयोग गरिएको छ, अन्तर्जात POI निकटता मार्करहरू पुन: निर्माण गर्ने रणनीतिहरू अनपेक्षित छन्।यहाँ, हामी फोटोएक्टिभेसन-डिपेन्डेन्ट प्रोक्सिमिटी लेबलिङ (PDPL) नामक प्लेटफर्म प्रस्तुत गर्छौं, जहाँ हामीले miniSOG फोटोसेन्सिटाइजरसँग फ्युज गरिएको POI लाई उज्यालो पार्न निलो बत्ती प्रयोग गर्छौं र प्रोक्सिमल अवशेषहरूलाई अक्सिडाइज गर्न सिंगल अक्सिजन जेनेरेशन ट्रिगर गर्छौं, त्यसपछि रासायनिक प्रोबहरूमा अक्सिडाइज गर्न अमाइन युक्त परिमार्जनहरू। मध्यवर्ती जीवित कोशिकाहरू।।हामीले ट्याग विशिष्टतालाई अधिकतम बनाउन रासायनिक प्रोबहरूको समूहको परीक्षण गर्‍यौं र खुला प्रोटोमिक्स कार्यप्रवाह प्रयोग गरेर परिमार्जन साइटहरू पहिचान गर्‍यौं।टर्बोआईडीसँग PDPL को छेउछाउको तुलनाले PDPL को थप विशिष्ट र व्यापक प्रोटोमिक कभरेज देखाउँछ।हामीले यो दृष्टिकोणलाई सबसेलुलर प्रोटोमको अर्गानेल-विशिष्ट मार्करहरू र क्यान्सर-सम्बद्ध एपिजेनेटिक नियामक प्रोटीन BRD4 र पार्किन्सन रोग-सम्बद्ध E3 ligase पार्किनको लागि बाध्यकारी साझेदारहरूको सामान्य प्रोटोम पहिचानमा लागू गर्यौं, जसले प्रोटीनको ज्ञात र अज्ञात नेटवर्क दुवै पुष्टि गर्‍यो। अन्तरक्रियाहरू।।ठूला प्रोटीन कम्प्लेक्सहरूमा E3 सब्सट्रेटहरू पहिचान गर्न PDPL को क्षमताले अप्रत्यक्ष बाइन्डरहरूको पहिचान आवश्यक पर्ने अवस्थालाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।ubiquitination-proteasome द्वारा मध्यस्थता गरिएको दुई अज्ञात पार्किन सब्सट्रेटहरू स्थितिमा पुष्टि भएका छन्।
फोटोडायनामिक थेरापी (PDT) 19 र क्रोमोफोर-असिस्टेड लेजर इनएक्टिभेसन (CALI) 20, जसमा फोटोसेन्सिटाइजरको साथ प्रकाश विकिरणले सिंगलट अक्सिजन उत्पन्न गर्दछ, लक्षित प्रोटीनहरू निष्क्रिय पार्न सक्छ वा कोशिकाको मृत्यु हुन सक्छ।चूंकि सिंगल अक्सिजन एक उच्च प्रतिक्रियाशील पदार्थ हो जसको सैद्धान्तिक प्रसार दूरी लगभग 70 एनएम हुन्छ, फोटोसेन्सिटाइजर वरपरको स्थानिय रूपमा सीमित अक्सीकरणलाई नियन्त्रण गर्न सकिन्छ।यस अवधारणाको आधारमा, हामीले जीवित कोशिकाहरूमा प्रोटीन कम्प्लेक्सहरूको नजिकको लेबलिङ प्राप्त गर्न सिंगल अक्सिजन प्रयोग गर्ने निर्णय गर्यौं।हामीले चार कार्यहरू पूरा गर्न PDPL केमोप्रोटोमिक दृष्टिकोणको विकास गरेका छौं: (1) PL इन्जाइम्याटिक दृष्टिकोण जस्तै सक्रिय सिंगल अक्सिजनको उत्पादनलाई उत्प्रेरित गर्न;(2) प्रकाश दीक्षामा समय-समाधान लेबलिंग प्रदान गर्नुहोस्;(३) परिवर्तनद्वारा (४) पृष्ठभूमि घटाउनको लागि अन्तर्जात कोफ्याक्टरहरू (जस्तै बायोटिन) प्रयोग नगर्नुहोस्, वा वातावरणीय तनावमा सेल एक्सपोजरलाई न्यूनीकरण गर्न अत्यधिक विचलित गर्ने एक्सोजेनस अभिकर्मकहरू (जस्तै पेरोक्साइडहरू) प्रयोग गर्नुहोस्।
फोटोसेन्सिटाइजरहरूलाई दुई भागमा विभाजन गर्न सकिन्छ जसमा सानो आणविक तौल फ्लोरोफोरहरू (जस्तै गुलाब बेङ्गल, मिथाइलिन नीलो) 22 र आनुवंशिक रूपमा इन्कोड गरिएका साना प्रोटीनहरू (उदाहरणका लागि miniSOG, KillerRed) 23।मोड्युलर डिजाइन प्राप्त गर्न, हामीले POI24,25 (चित्र 1a) मा फोटोसेन्सिटाइजर (PS) प्रोटिनहरू थपेर पहिलो पुस्ताको PDPL प्लेटफर्मको विकास गर्यौं।जब नीलो प्रकाशको साथ विकिरण गरिन्छ, सिंगलट अक्सिजनले प्रोक्सिमल न्यूक्लियोफिलिक एमिनो एसिड अवशेषहरूलाई अक्सिडाइज गर्दछ, परिणामस्वरूप एक umpolung ध्रुवता हुन्छ जुन इलेक्ट्रोफिलिक हुन्छ र अझ अमाइन प्रोब न्यूक्लियोफाइल्ससँग प्रतिक्रिया गर्न सक्छ 16,17।प्रोबलाई क्लिक केमिस्ट्रीलाई अनुमति दिन र एलसी/एमएस/एमएस क्यारेक्टराइजेसनको लागि तल तान्न अनुमति दिन अल्काइन ह्यान्डलसँग डिजाइन गरिएको हो।
miniSOG द्वारा मध्यस्थता गरिएको प्रोटीन कम्प्लेक्सको लेबलिंगको योजनाबद्ध चित्रण।नीलो प्रकाशमा पर्दा, miniSOG-POI व्यक्त गर्ने कोशिकाहरूले सिंगल अक्सिजन उत्पन्न गर्छ, जसले अन्तरक्रिया गर्ने प्रोटीनहरूलाई परिमार्जन गर्छ तर गैर-बाध्यकारी प्रोटीनहरू होइन।फोटोअक्सिडेशनको मध्यवर्ती उत्पादनहरू कोभ्यालेन्ट एडक्ट्स बनाउनको लागि अमाइन केमिकल प्रोबको रिले लेबलहरूद्वारा रोकिन्छ।केमिस्ट्री प्रोबमा रहेको अल्काइनिल समूहले LC-MS/MS quantitation पछि पुल-डाउन द्वारा समृद्धिको लागि क्लिक केमिस्ट्रीलाई अनुमति दिन्छ।ख एमाइन प्रोबको रासायनिक संरचना 1-4।c प्रतिनिधि फ्लोरोसेन्ट जेल विश्लेषण माइटोकोन्ड्रियल स्थानीयकृत miniSOG-मध्यस्थ प्रोटोमिक मार्करहरू प्रोबहरू 1-4 प्रयोग गरेर र जेल डेन्सिटोमेट्रीमा आधारित सापेक्ष मात्रा।नीलो प्रकाश बाहेक नकारात्मक नियन्त्रण प्रयोगहरू प्रयोग गरेर वा miniSOG अभिव्यक्ति बिना HEK293T कक्षहरू प्रयोग गरेर रासायनिक अनुसन्धानहरूको संकेत-देखि-पृष्ठभूमि अनुपात मूल्याङ्कन गरिएको थियो।n = 2 जैविक रूपमा स्वतन्त्र नमूनाहरू।प्रत्येक बिन्दुले जैविक प्रतिकृति प्रतिनिधित्व गर्दछ।d संकेतित PDPL कम्पोनेन्टहरूको उपस्थिति वा अनुपस्थितिमा अनुकूलित प्रोब 3 को प्रयोग गरी PDPL को प्रतिनिधि पत्ता लगाउने र परिमाणीकरण गर्ने।n = 3 जैविक रूपमा स्वतन्त्र नमूनाहरू।प्रत्येक बिन्दुले जैविक प्रतिकृति प्रतिनिधित्व गर्दछ।केन्द्ररेखा र व्हिस्कर्सले औसत र ± मानक विचलनलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।CBB: Coomassie ब्रिलियन्ट ब्लू।e टाढा-रातो Si-DMA दागको साथ सिंगल अक्सिजनको कन्फोकल इमेजिङ।स्केल बार: 10 माइक्रोन।जेल इमेजिङ र कन्फोकल प्रयोगहरू समान परिणामहरूको साथ कम्तिमा दुई पटक स्वतन्त्र रूपमा दोहोर्याइएको थियो।
हामीले पहिलो पटक परिपक्व फोटोसेन्सिटाइजरहरू miniSOG26 र KillerRed23 को क्षमता परीक्षण गर्‍यौं, स्थिर रूपमा HEK293T मा व्यक्त गरिएको, प्रोटोमको प्रोपर्जिलामाइन लेबलिंगलाई रासायनिक जाँचको रूपमा मध्यस्थता गर्न (पूरक चित्र १a)।जेल फ्लोरोसेन्स विश्लेषणले देखायो कि सम्पूर्ण प्रोटोम लेबलिंग miniSOG र नीलो प्रकाश विकिरण प्रयोग गरेर हासिल गरिएको थियो, जबकि KillerRed सँग कुनै देखिने लेबलिंग उत्पादन अवलोकन गरिएको थिएन।संकेत-देखि-पृष्ठभूमि अनुपात सुधार गर्न, हामीले त्यसपछि एनिलिन (1 र 3), प्रोपाइलामाइन (2), वा बेन्जिलामाइन (4) युक्त रासायनिक प्रोबहरूको सेट परीक्षण गर्‍यौं।हामीले अवलोकन गर्‍यौं कि HEK293T कोशिकाहरूमा निलो प्रकाश नभएको तुलनामा उच्च पृष्ठभूमि संकेत थियो, सम्भवतः अन्तर्जात राइबोफ्लेभिन फोटोसेन्सिटाइजर, फ्लेभिन मोनोन्यूक्लियोटाइड (FMN) 27 को कारणले। Aniline-आधारित रासायनिक प्रोबहरू 1 र 3 ले राम्रो विशिष्टता दियो, HEK293T ले माइटोकन्ड्रियामा miniSOG लाई स्थिर रूपमा प्रोब 3 को लागि संकेतमा 8-गुना वृद्धि प्रदर्शन गर्दै, जबकि RNA-लेबलिङ विधि CAP-seq मा प्रयोग गरिएको प्रोब 2 ले ~2.5- मात्र प्रदर्शन गर्दछ। फोल्ड संकेत वृद्धि, सम्भवतः RNA र प्रोटीन (चित्र 1b, c) बीचको भिन्न प्रतिक्रिया प्राथमिकताहरूको कारणले। Aniline-आधारित रासायनिक प्रोबहरू 1 र 3 ले राम्रो विशिष्टता दियो, HEK293T ले माइटोकन्ड्रियामा miniSOG लाई स्थिर रूपमा प्रोब 3 को लागि संकेतमा 8-गुना वृद्धि प्रदर्शन गर्दै, जबकि RNA-लेबलिङ विधि CAP-seq मा प्रयोग गरिएको प्रोब 2 ले ~2.5- मात्र प्रदर्शन गर्दछ। फोल्ड संकेत वृद्धि, सम्भवतः RNA र प्रोटीन (चित्र 1b, c) बीचको भिन्न प्रतिक्रिया प्राथमिकताहरूको कारणले।Aniline-आधारित रासायनिक जाँचहरू 1 र 3 ले राम्रो विशिष्टता देखायो: HEK293T, जसले माइटोकोन्ड्रियामा miniSOG लाई स्थिर रूपमा व्यक्त गर्दछ, प्रोब 3 को लागि संकेतमा 8-गुना भन्दा बढी वृद्धि देखाउँदछ, जबकि प्रोब 2, CAP-seq RNA लेबलिङ विधिमा प्रयोग गरिन्छ, मात्र। ~2.5-गुणा संकेत वृद्धि देखाउँछ, सम्भवतः RNA र प्रोटीन (चित्र 1b, c) बीचको भिन्न प्रतिक्रिया प्राथमिकताहरूको कारणले।基于 苯胺 的 的 的 化学 化学 探针 探针 特异性 特异性 好 好 特异性 特异性 特异性的 特异性 线 粒体 粒体 中 表达 表达 表达 表达 表达 表达 信号 信号 增加 增加 增加 增加 增加 于 方法 方法 方法 方法 方法 仅 仅 2 显示 显示 显示显示2.5-倍信号增加, 可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b,c）।基于 苯胺 的 的 的 化学 化学 探针 探针 特异性 特异性 的 的 特异性 特异性 特异性 表达 中 中 稳定 表达 表达 表达 信号 信号 增加 增加 增加 增加 于 于 于 于 于 于 标记 仅 ~ ~ 2। - 倍信号增加, 可能是由于RNAAniline-आधारित रासायनिक अनुसन्धान 1 र 3 ले राम्रो विशिष्टता थियो, HEK293T ले माइटोकन्ड्रियामा miniSOG स्थिर रूपमा व्यक्त गर्यो, र प्रोब 3 ले संकेतमा 8-गुना वृद्धि गरेको थियो, जबकि CAP-seq RNA लेबलिङ विधिको लागि प्रोब 2 ले मात्र ~ 2.5-गुना वृद्धि देखाएको थियो।संकेतमा, सम्भवतः RNA र प्रोटीन (चित्र 1b, c) बीच फरक प्रतिक्रिया प्राथमिकताहरूको कारणले।थप रूपमा, प्रोब 3 आइसोमर र हाइड्राजिन प्रोबहरू (प्रोबहरू 5, 6, 7) परीक्षण गरियो, प्रोब 3 (पूरक चित्र 1b,c) को अनुकूलन पुष्टि गर्दै।त्यस्तै गरी, इन-जेल प्रतिदीप्ति विश्लेषणले अन्य अनुकूलित प्रयोगात्मक मापदण्डहरू प्रकट गर्‍यो: विकिरण तरंगदैर्ध्य (460 nm), रासायनिक जाँच एकाग्रता (1 mM), र विकिरण समय (20 मिनेट) (पूरक चित्र 2a–c)।PDPL प्रोटोकलमा कुनै पनि कम्पोनेन्ट वा चरण छोड्दा पृष्ठभूमिमा महत्त्वपूर्ण संकेत उल्टो हुन्छ (चित्र 1d)।उल्लेखनीय रूपमा, सोडियम एजाइड वा ट्रोलोक्सको उपस्थितिमा प्रोटीन लेबलिंग उल्लेखनीय रूपमा कम भएको थियो, जुन सिंगल अक्सिजन निभाउन जानिन्छ।D2O को उपस्थिति, जो एकल अक्सिजन स्थिर गर्न जानिन्छ, लेबलिङ संकेत बढाउँछ।लेबलिङमा अन्य प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरूको योगदान अनुसन्धान गर्न, म्यानिटोल र भिटामिन सी क्रमशः 18, 29, हाइड्रोक्सिल र सुपरअक्साइड रेडिकल स्क्याभेन्जरहरू स्थापना गर्न थपियो, तर तिनीहरूले लेबलिङ घटाउन सकेनन्।H2O2 को थप, तर रोशनी होइन, लेबलिङमा परिणाम भएन (पूरक चित्र 3a)।Si-DMA प्रोबहरूको साथ फ्लोरोसेन्स सिंगल अक्सिजन इमेजिङले HEK293T-miniSOG तारमा सिंगल अक्सिजनको उपस्थिति पुष्टि गर्‍यो, तर मूल HEK293T तारमा होइन।थप रूपमा, mitoSOX Red ले रोशनी पछि सुपरअक्साइड उत्पादन पत्ता लगाउन सकेन (Fig. 1e र पूरक Fig. 3b) 30. यी डेटाले दृढतापूर्वक सुझाव दिन्छ कि सिंगल अक्सिजन पछिको प्रोटोमिक लेबलिङको लागि जिम्मेवार मुख्य प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजाति हो।PDPL को साइटोटोक्सिसिटी नीलो प्रकाश विकिरण र रासायनिक जाँचहरू सहित मूल्याङ्कन गरिएको थियो, र कुनै महत्त्वपूर्ण साइटोटोक्सिसिटी अवलोकन गरिएको थिएन (पूरक चित्र 4a)।
लेबलिङ मेकानिजम अध्ययन गर्न र LC-MS/MS प्रयोग गरेर प्रोटीन कम्प्लेक्सहरूको प्रोटोमिक पहिचान सक्षम गर्न, हामीले पहिले कुन एमिनो एसिड परिमार्जन गरिएको छ र प्रोब लेबलहरूको डेल्टा मास निर्धारण गर्न आवश्यक छ।Methionine, histidine, tryptophan र tyrosine लाई सिंगल अक्सिजन 14,15 द्वारा परिमार्जन गरिएको रिपोर्ट गरिएको छ।हामीले TOP-ABPP31 कार्यप्रवाहलाई MSFragger32 मा आधारित FragPipe कम्प्युटिङ प्लेटफर्मद्वारा प्रदान गरिएको निष्पक्ष खुला खोजसँग एकीकृत गर्छौं।सिंगल अक्सिजन परिमार्जन र रासायनिक प्रोब लेबलिङ पछि, क्लीभेबल लिंकर भएको बायोटिन रिडक्शन लेबल प्रयोग गरेर क्लिक केमिस्ट्री गरिएको थियो, त्यसपछि न्यूट्राभिडिन स्ट्रेचिङ र ट्रिप्सिन पाचन।परिमार्जित पेप्टाइड, अझै पनि रालमा बाँधिएको, LC-MS/MS विश्लेषणको लागि फोटोक्लिभ गरिएको थियो (चित्र 2a र पूरक डेटा 1)।50 भन्दा बढी पेप्टाइड नक्सा (PSM) मिल्दो सूचीबद्ध (चित्र 2b) सँग प्रोटोम भरि धेरै परिमार्जनहरू भयो।अचम्मको कुरा, हामीले हिस्टिडाइनको परिमार्जन मात्र देख्यौं, सायद अन्य एमिनो एसिडहरूको तुलनामा एनिलिन प्रोबहरूमा अक्सिडाइज्ड हिस्टिडाइनको उच्च प्रतिक्रियाको कारणले।सिंगल अक्सिजनद्वारा हिस्टिडाइन अक्सिडेशनको प्रकाशित मेकानिजम अनुसार, 21,33 +229 Da को प्रस्तावित डेल्टा-मास ढाँचा दुई-अक्सो-हिस्टिडाइनको साथ दुई ओक्सिडेशन पछि प्रोब 3 को एडक्टसँग मेल खान्छ, जबकि +247 Da हाइड्रोलाइसिस उत्पादन हो। +२२९ दा (पूरक चित्र ५)।MS2 स्पेक्ट्रमको मूल्याङ्कनले परिमार्जित टुक्रा आयनहरू (y र b) (चित्र 2c) को पहिचान सहित y र b आयनहरूको धेरैजसो पहिचानको उच्च विश्वसनीयता देखाएको छ।PDPL-परिमार्जित हिस्टिडाइनहरूको स्थानीय अनुक्रमको सन्दर्भ विश्लेषणले ±1 स्थानहरूमा साना हाइड्रोफोबिक अवशेषहरूको लागि मध्यम आकृति प्राथमिकता प्रकट गर्‍यो (पूरक चित्र। 4b)।औसतमा, प्रति प्रोटीन 1.4 हिस्टिडाइनहरू पहिचान गरियो, र यी मार्करहरूको साइटहरू विलायक पहुँचयोग्य सतह क्षेत्र (SASA) र सापेक्ष विलायक उपलब्धता (RSA) विश्लेषण (पूरक चित्र 4c,d) द्वारा निर्धारण गरिएको थियो।
MSFragger द्वारा संचालित FragPipe कम्प्युटिङ प्लेटफर्म प्रयोग गरेर अवशिष्ट चयनात्मकता अध्ययनको लागि एक निष्पक्ष कार्यप्रवाह।स्ट्रेप्टाभिडिन रालबाट परिमार्जित पेप्टाइडहरूको फोटोक्लिभेजलाई अनुमति दिन क्लिक रसायनशास्त्रमा क्लीभयोग्य लिङ्करहरू प्रयोग गरिन्छ।धेरै परिमार्जनहरू, साथै सान्दर्भिक अवशेषहरू पहिचान गर्न खुला खोजी सुरु गरिएको थियो।b सम्पूर्ण प्रोटोममा हुने परिमार्जनहरूको मास असाइन गर्नुहोस्।पेप्टाइड म्यापिङ PSM।c MS2 हिस्टिडाइन साइटहरूको स्पेक्ट्रल एनोटेशन प्रोब 3 को साथ परिमार्जन गरियो। प्रतिनिधि उदाहरणको रूपमा, प्रोब 3 को साथ एक सहसंयोजक प्रतिक्रियाले परिमार्जित एमिनो एसिडमा +229.0938 Da थप्यो।d उत्परिवर्तन परख PDPL मार्करहरूको लागि परीक्षण गर्न प्रयोग गरिन्छ।PRDX3 (H155A, H225A) र PRDX1 (H10A, H81A, H169A) लाई एन्टी-फ्ल्याग पत्ता लगाउन जंगली-प्रकारको प्लाज्मिडहरूद्वारा रूपान्तरण गरिएको थियो।e सिंथेटिक पेप्टाइडलाई प्रोब 3 को उपस्थितिमा शुद्ध miniSOG सँग प्रतिक्रिया गरिएको थियो र Δm +247 र +229 सँग सम्बन्धित उत्पादनहरू LC-MS स्पेक्ट्रममा नोट गरिएको थियो।f इन भिट्रो प्रोटीन-देखि-प्रोटिन अन्तरक्रियाहरू miniSOG-6xHis-ट्याग र एन्टि-6xHis एन्टिबडीसँग मोडेल गरिएको।एन्टिबायोटिन (स्ट्रेप्टाभिडिन-एचआरपी) र एन्टि-माउस वेस्टर्न ब्लट विश्लेषण miniSOG-6xHis/anti-6xHis एन्टिबडी कम्प्लेक्सहरू प्रोब 3 का साथ लेबल गरिएको, प्रकाशको जोखिमको समयको आधारमा।व्यक्तिगत प्रोटीनहरूको लागि लेबलहरू सम्बन्धित आणविक वजनमा व्यक्त गरिन्छ: LC एन्टिबडी लाइट चेन, HC एन्टिबडी भारी चेन।यी प्रयोगहरू स्वतन्त्र रूपमा समान परिणामहरूका साथ कम्तिमा दुई पटक दोहोर्याइएको थियो।
लेबलिङ साइटको बायोकेमिकल प्रमाणिकरणको लागि, मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहिचान गरिएको PRDX3 र PRDX1 लाई हिस्टिडाइनबाट एलानाइनमा परिवर्तन गरियो र ट्रान्सफेक्सन एसेसहरूमा जंगली प्रकारको तुलनामा।PDPL नतिजाहरूले देखाए कि उत्परिवर्तनले उल्लेखनीय रूपमा लेबलिङ घटाएको छ (चित्र 2d)।यसैबीच, खुला खोजमा पहिचान गरिएका पेप्टाइड अनुक्रमहरूलाई प्रोब ३ र निलो प्रकाशको उपस्थितिमा शुद्ध miniSOG सँग भिट्रोमा संश्लेषित र प्रतिक्रिया गरिएको थियो, LC-MS द्वारा पत्ता लाग्दा +247 र +229 Da को मास शिफ्टको साथ उत्पादनहरू (चित्र 2e)।)।miniSOG फोटोएक्टिभेसनको प्रतिक्रियामा अन्तर्क्रिया गर्ने प्रोक्सिमल प्रोटीनहरू भिट्रोमा लेबल गर्न सकिन्छ कि भनेर परीक्षण गर्न, हामीले miniSOG-6xHis प्रोटीन र भिट्रोमा एन्टि-हिस मोनोक्लोनल एन्टिबडी (चित्र 2f) बीचको अन्तरक्रियाद्वारा कृत्रिम निकटता परख डिजाइन गर्यौं।यस परखमा, हामीले miniSOG सँग एन्टिबडी भारी र हल्का चेनहरूको प्रोक्सिमल लेबलिंगको अपेक्षा गरेका थियौं।वास्तवमा, एन्टी-माउस (एन्टि-6xHis-लेबल गरिएको एन्टिबडीको भारी र हल्का चेनहरू पहिचान गर्दै) र स्ट्रेप्टाभिडिन वेस्टर्न ब्लटहरूले भारी र हल्का चेनको बलियो बायोटिनाइलेशन देखाए।विशेष रूपमा, हामीले 6xHis ट्याग र प्रकाश र भारी चेनहरू बीचको क्रस-लिङ्कहरूको कारणले miniSOG autobiotinylation देख्यौं, जुन लाइसिन र 2-oxo-हिस्टिडाइन प्रक्सिमल प्रतिक्रिया बीचको पहिले वर्णन गरिएको अन्तरसँग सम्बन्धित हुन सक्छ।निष्कर्षमा, हामी निष्कर्षमा पुग्छौं कि PDPL ले हिस्टिडाइनलाई निकटतामा निर्भर तरीकाले परिमार्जन गर्दछ।
हाम्रो अर्को लक्ष्य सिटू लेबलिङको विशिष्टता परीक्षण गर्न सबसेलुलर प्रोटोमको विशेषता थियो।त्यसकारण, हामीले न्यूक्लियस, माइटोकोन्ड्रियल म्याट्रिक्स, वा HEK293T कोशिकाहरूको बाहिरी ER झिल्ली (चित्र 3a) मा स्थिर रूपमा miniSOG व्यक्त गर्यौं।जेल फ्लोरोसेन्स विश्लेषणले तीन सबसेलुलर स्थानहरूमा प्रचुर मात्रामा लेबल गरिएका ब्यान्डहरू साथै विभिन्न लेबलिङ ढाँचाहरू (चित्र 3b) पत्ता लगाए।फ्लोरोसेन्स इमेजिङ विश्लेषणले PDPL (चित्र 3c) को उच्च विशिष्टता देखायो।PDPL कार्यप्रवाहलाई फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपी प्रयोग गरेर सबसेलुलर प्रोटोमहरू चित्रण गर्न रोडामाइन रंगहरूसँग क्लिक प्रतिक्रियाहरू द्वारा पछ्याइएको थियो, र PDPL संकेतहरू DAPI, माइटोकोन्ड्रियल ट्र्याकरहरू, वा ER ट्र्याकरहरूसँग स्थानीयकरण गरिएको थियो, PDPL को उच्च निष्ठा पुष्टि गर्दै।तीनवटा अर्गानेल स्थानहरूको लागि, एविडिन वेस्टर्न ब्लट प्रयोग गरी PDPL को TurboID सँगको छेउ-छेउको तुलनाले PDPL लाई तिनीहरूको सम्बन्धित नियन्त्रणको तुलनामा विशेष रूपमा लेबल गरिएको देखाएको छ।PDPL सर्तहरूमा, थप लेबल गरिएका ब्यान्डहरू देखा पर्‍यो, जसले थप PDPL-लेबल गरिएका प्रोटिनहरूलाई सङ्केत गर्छ (पूरक चित्र 6a-d)।
miniSOG-मध्यस्थ organelle-विशिष्ट प्रोटिओम लेबलिंगको योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।miniSOG ले माइटोकोन्ड्रियल म्याट्रिक्सलाई मानव COX4 (mito-miniSOG) को N-टर्मिनल 23 एमिनो एसिडहरू, H2B (न्यूक्लियस-miniSOG) को फ्यूजन मार्फत न्यूक्लियस, र ER झिल्लीको साइटोप्लाज्मिक पक्ष (ER-miniSOG) मार्फत Sec61β मा फ्युजन मार्फत लक्ष्य गर्दछ। )।संकेतहरूमा जेल इमेजिङ, कन्फोकल इमेजिङ, र मास स्पेक्ट्रोमेट्री समावेश छ।b तीन organelle-विशिष्ट PDPL प्रोफाइलहरूको प्रतिनिधि जेल छविहरू।CBB Coomassie ब्रिलियन्ट ब्लू।c HEK293T कोशिकाहरूको प्रतिनिधि कन्फोकल छविहरू V5 (रातो) लेबल गरिएको एन्टिबडी द्वारा पत्ता लगाइएका विभिन्न सबसेलुलर स्थानीयकरणहरूसँग miniSOG लाई स्थिर रूपमा व्यक्त गर्दछ।सबसेलुलर मार्करहरू mitochondria र ER (हरियो) को लागि प्रयोग गरिन्छ।PDPL कार्यप्रवाहले Cy3-azide क्लिक रसायन प्रयोग गरेर miniSOG (पहेंलो) लेबल गरिएको सबसेलुलर प्रोटोमहरू पत्ता लगाउने समावेश गर्दछ।स्केल बार: 10 माइक्रोन।d विभिन्न अंगहरूमा PDPL-ट्याग गरिएका प्रोटोमहरूको ज्वालामुखी प्लटहरू लेबल नगरिएको परिमाणीकरण (n = 3 स्वतन्त्र जैविक प्रयोगहरू) द्वारा परिमाणित।दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी-टेस्ट ज्वालामुखी प्लटहरूमा प्रयोग गरिएको थियो।HEK293T जंगली प्रकार नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन गरिएका प्रोटीनहरू रातो (p <0.05 र> 2-गुणा आयन तीव्रता भिन्नता) मा हाइलाइट गरिएका छन्। महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन गरिएका प्रोटीनहरू रातो (p <0.05 र> 2-गुणा आयन तीव्रता भिन्नता) मा हाइलाइट गरिएका छन्। Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)। महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन गरिएका प्रोटिनहरू रातोमा हाइलाइट गरिएका छन् (p <0.05 र> आयन तीव्रतामा 2-गुणा भिन्नता)।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)। महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन गरिएका प्रोटिनहरू रातोमा हाइलाइट गरिएका छन् (p <0.05 र > आयनिक शक्तिमा 2-गुणा भिन्नता)।HEK293T-miniSOG का लागि महत्त्वपूर्ण तर HEK293T का लागि महत्त्वपूर्ण नभएका सम्बन्धित प्रोटीनहरू हरियो रंगमा देखाइएका छन्।e प्रयोगहरूबाट प्रोटिओमिक डेटासेटहरूको विशिष्टताको विश्लेषण d।प्रत्येक अंगमा (रातो र हरियो थोप्लाहरू) मा सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण प्रोटीनहरूको कुल संख्या शीर्षमा चिन्ह लगाइएको छ।हिस्टोग्रामहरूले MitoCarta 3.0, GO विश्लेषण र A. Ting et al को आधारमा अर्गानेल्समा स्थानीयकृत प्रोटीनहरू देखाउँछन्।मानिसहरू।mitochondria, nuclei, र ER को लागि अलग डाटासेट।यी प्रयोगहरू स्वतन्त्र रूपमा समान परिणामहरूका साथ कम्तिमा दुई पटक दोहोर्याइएको थियो।कच्चा डाटा कच्चा डाटा फाइल को रूप मा प्रदान गरिन्छ।
जेल र इमेजिङ नतिजाहरू द्वारा प्रोत्साहित गरिएको, लेबल-मुक्त क्वान्टिफिकेशन प्रत्येक अर्गानेल (पूरक डाटा 2) मा पहिचान गरिएको प्रोटोम परिमाण गर्न प्रयोग गरिएको थियो।Untransfected HEK293T पृष्ठभूमि मार्कर घटाउन नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। ज्वालामुखी प्लट विश्लेषणले उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध प्रोटीनहरू (p <0.05 र > 2-गुणा आयन तीव्रता) साथै सिंगलटन प्रोटीनहरू प्रदर्शन गर्यो जुन miniSOG-एक्सप्रेसिङ लाइनहरूमा मात्र उपस्थित हुन्छन् (चित्र 3d रातो र हरियो थोप्लाहरू)। ज्वालामुखी प्लट विश्लेषणले उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध प्रोटीनहरू (p <0.05 र > 2-गुणा आयन तीव्रता) साथै सिंगलटन प्रोटीनहरू प्रदर्शन गर्यो जुन miniSOG-एक्सप्रेसिङ लाइनहरूमा मात्र उपस्थित हुन्छन् (चित्र 3d रातो र हरियो थोप्लाहरू)। Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ज्वालामुखी प्लट विश्लेषणले उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध प्रोटीनहरू (p <0.05 र > 2-गुणा आयन तीव्रता) साथै एकल प्रोटीनहरू देखाएको छ जुन केवल miniSOG-एक्सप्रेसिङ लाइनहरूमा अवस्थित छन् (चित्र 3d, रातो र हरियो थोप्लाहरू)।火山图 分析 显示 显示 出 显着 显着 的 蛋白质 蛋白质 蛋白质 (p <0. 0.05 和) 以及 仅 存 离子 强度 强度) 以及 仅 存 存 在于 的 的 单一 蛋白质 (图 中 红色 红色 蛋白质 蛋白质)।火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). ज्वालामुखी प्लट विश्लेषणले उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध प्रोटीनहरू (p <0.05 र > 2x आयनिक शक्ति) साथै एकल प्रोटीनहरू मात्र miniSOG अभिव्यक्ति रेखामा (चित्र 3d मा रातो र हरियो थोप्लाहरू) मा उपस्थित भएको खुलासा गर्‍यो।यी डाटाहरू संयोजन गर्दै, हामीले क्रमशः 1364, 461, र 911 सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण परमाणु, माइटोकोन्ड्रियल, र ER बाहिरी झिल्ली प्रोटीनहरू पहिचान गर्यौं।Organelle-स्थानीयकृत PDPL को शुद्धता विश्लेषण गर्न, हामीले MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) विश्लेषण, र A. Ting et al प्रयोग गर्यौं।73.4, 78.5, र 73.0% (चित्र 3e) को शुद्धतासँग मेल खाँदा पत्ता लगाइएका प्रोटिनहरूको अर्गनेल विशिष्टता परीक्षण गर्न माइटोकोन्ड्रिया, न्यूक्लियस र ER को लागि डेटा सेट8 प्रयोग गरिएको थियो।PDPL को विशिष्टताले पुष्टि गर्छ कि PDPL organelle-विशेष प्रोटोमहरू पहिचान गर्नको लागि एक आदर्श उपकरण हो।विशेष रूपमा, पहिचान गरिएको माइटोकोन्ड्रियल प्रोटीनहरूको सबमिटोकोन्ड्रियल विश्लेषणले देखाएको छ कि फँसेको प्रोटोम मुख्यतया म्याट्रिक्स र भित्री झिल्ली (क्रमशः 226 र 106) मा वितरित गरिएको थियो, पहिचान गरिएका माइटोकोन्ड्रियल प्रोटीनहरूको कुल संख्याको 91.7% (362) को लागि लेखांकन।PDPL को उच्च स्तर थप पुष्टि भयो (पूरक चित्र 7a)।त्यस्तै, सबन्यूक्लियर विश्लेषणले देखाएको छ कि कब्जा गरिएको प्रोटोम मुख्यतया न्यूक्लियस, न्यूक्लियोप्लाज्म र न्यूक्लियोलस (पूरक चित्र 7b) मा वितरित गरिएको थियो।आणविक स्थानीयकरण संकेत पेप्टाइड (3xNLS) को साथ परमाणु प्रोटियोमिक विश्लेषणले H2B निर्माण (पूरक चित्र 7c–h) को समान सटीकता देखायो।PDPL मार्करको विशिष्टता निर्धारण गर्न, आणविक ल्यामिनिन A लाई अधिक अस्पष्ट रूपमा स्थानीयकृत POI7 जालको रूपमा छनोट गरिएको थियो।PDPL ले 36 उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध प्रोटीनहरू पहिचान गर्‍यो, जसमध्ये 12 प्रोटीनहरू (30.0% लेमिन ए सहित) स्ट्रिङ डाटाबेसद्वारा एनोटेट गरिएको राम्ररी विशेषतायुक्त ल्यामिन ए अन्तरक्रिया गर्ने प्रोटीनहरू थिए, जसमा 28 को BioID विधि (122 प्रोटिनहरू) 28 को तुलनामा उच्च प्रतिशत थियो। , 22.9 %) 7. हाम्रो विधिले कम प्रोटीनहरू पहिचान गर्यो, सम्भवतः सीमित लेबलिङ क्षेत्रहरूको कारणले गर्दा, जुन अधिक सक्रिय सिंगल अक्सिजनद्वारा सम्भव भएको थियो।GO विश्लेषणले देखाएको छ कि पहिचान गरिएका प्रोटीनहरू मुख्यतया न्यूक्लियोप्लाज्म (26), परमाणु झिल्ली (10), परमाणु झिल्ली (9), र परमाणु छिद्र (5) मा अवस्थित थिए।सामुहिक रूपमा, यी आणविक-स्थानीयकृत प्रोटीनहरू समृद्ध प्रोटीनहरूको 80% को लागि जिम्मेवार छन्, थप PDPL (पूरक चित्र 8a–d) को विशिष्टता प्रदर्शन गर्दै।
Organelles मा निकटता मार्किङ प्रदर्शन गर्न PDPL को क्षमता स्थापित गरिसकेपछि, हामीले PDPL POI बाध्यकारी साझेदारहरूको विश्लेषण गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ कि भनेर परीक्षण गर्यौं।विशेष गरी, हामीले साइटोसोलिक प्रोटीनहरूको PDPL विश्लेषणलाई परिभाषित गर्न खोज्यौं, जुन तिनीहरूको अत्यधिक गतिशील प्रकृतिको कारण तिनीहरूको झिल्ली-स्थानीय समकक्षहरू भन्दा बढी कठिन लक्ष्यहरू मानिन्छ।ब्रोमोडोमेन र एक्स्ट्राटरमिनल (BET) प्रोटीन BRD4 ले विभिन्न रोगहरूमा यसको मुख्य भूमिकाको लागि हाम्रो ध्यान आकर्षित गरेको छ 35, 36।BRD4 द्वारा गठित जटिल एक ट्रान्सक्रिप्शनल कोएक्टिवेटर र एक महत्वपूर्ण उपचारात्मक लक्ष्य हो।C-myc र Wnt5a ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरूको अभिव्यक्तिलाई विनियमित गरेर, BRD4 एक्यूट माइलोइड ल्यूकेमिया (एएमएल), मल्टिपल माइलोमा, बुर्किटको लिम्फोमा, कोलोन क्यान्सर र भडकाउने रोगहरू 37,38 को मुख्य निर्धारक मानिन्छ।थप रूपमा, केही भाइरसहरूले BRD4 लाई भाइरल र सेलुलर ट्रान्सक्रिप्सनलाई नियन्त्रण गर्न लक्षित गर्छन्, जस्तै papillomavirus, HIV, र SARS-CoV-236,39।
PDPL प्रयोग गरेर BRD4 अन्तरक्रियालाई नक्सा गर्न, हामीले miniSOG लाई BRD4 को छोटो N- वा C-टर्मिनल isoform सँग जोड्यौं।प्रोटोमिक परिणामहरूले दुई निर्माणहरू (पूरक चित्र 9a) बीचको उच्च स्तरको ओभरल्याप प्रकट गर्यो।miniSOG-H2B सँग पहिचान गरिएको आणविक प्रोटोमले BRD4 (पूरक चित्र 9b) सँग अन्तरक्रिया गर्ने प्रोटीनहरूको 77.6% कभर गर्दछ।त्यसपछि, मार्कर त्रिज्या (चित्र 4a र पूरक डेटा 3) समायोजन गर्न प्रकाशको विभिन्न समयहरू (2, 5, 10, 20 मिनेट) प्रयोग गरियो।हामी निष्कर्षमा पुग्छौं कि छोटो फोटोपेरियडहरूमा, PDPL ले मुख्य रूपमा प्रत्यक्ष बाध्यकारी साझेदारहरूलाई लेबल गर्नेछ, जबकि लामो अवधिहरूमा छोटो फोटोएक्टिभेसन अवधिहरूमा पहिचान गरिएका प्रोटिनहरू साथै लेबलिङ कम्प्लेक्सहरूमा अप्रत्यक्ष लक्ष्यहरू समावेश हुनेछन्।वास्तवमा, हामीले नजिकैको समय बिन्दुहरू (2 र 5 मिनेटको लागि 84.6%; 5 र 10 मिनेटको लागि 87.7%; 10 र 20 मिनेटको लागि 98.7%) बीच बलियो ओभरल्याप फेला पार्यौं (चित्र 4b र पूरक चित्र 9c)।सबै प्रयोगात्मक समूहहरूमा, हामीले BRD4 स्व-लेबलिङ मात्र होइन, तर धेरै ज्ञात लक्ष्यहरू जस्तै MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, र HMGB1 स्ट्रिङ डाटाबेसमा एनोटेट फेला पार्यौं।यी लक्ष्यहरूको आयनिक शक्ति एक्सपोजर समय (चित्र 4c र पूरक चित्र 9d) को समानुपातिक छ।२-मिनेट समूहमा पहिचान गरिएका प्रोटिनहरूको GO विश्लेषणले पहिचान गरिएका प्रोटिनहरू न्यूक्लियसमा स्थानीयकरण गरिएको र क्रोमाटिन रिमोडेलिंग र आरएनए पोलिमरेज प्रकार्यमा संलग्न रहेको देखाएको छ।प्रोटीनको आणविक कार्य क्रोमाटिन बाइन्डिङ वा ट्रान्सक्रिप्शनल कोएक्टिभेसनमा समृद्ध थियो, BRD4 प्रकार्य (चित्र 4d) सँग अनुरूप।स्ट्रिङ डाटाबेस-सक्षम प्रोटीन अन्तरक्रिया विश्लेषणले BRD4 र HDAC परिवार अन्तरक्रिया गर्ने कम्प्लेक्सहरू जस्तै SIN3A, NCOR2, BCOR, र SAP130 (Fig. 4e र पूरक Fig. 9e) बीचको अप्रत्यक्ष अन्तरक्रियाको पहिलो स्तर प्रकट गर्‍यो, BRD4 र HDAC बाइन्डिङले आफ्नो एसिटिलेटेड एसिटिलेटेड। ।।थप रूपमा, Sin3A, NSUN2, Fus, र SFPQ सहित LC-MS/MS द्वारा पहिचान गरिएका प्रतिनिधि लक्ष्यहरू, पश्चिमी ब्लोटिंग (चित्र 4f) द्वारा पुष्टि गरिएको थियो।भर्खरै, BRD4 को छोटो आइसोफर्मले तरल-तरल चरण विभाजन (LLPS) गुणहरूको साथ न्यूक्लियहरू गठन गरेको रिपोर्ट गरिएको छ।आरएनए बाइन्डिङ प्रोटीनहरू Fus र SFPQ ले विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाहरूको LLPS मध्यस्थता गर्दछ र यहाँ रेकर्ड नगरिएको BRD4 बाध्यकारी प्रोटीनहरूको रूपमा पहिचान गरिएको छ।BRD4 र SFPQ बीचको अन्तरक्रिया को-इम्युनोप्रेसिपिटेशन (को-आईपी) प्रयोगहरू (चित्र 4g) द्वारा पुष्टि गरिएको थियो, BRD4-मध्यस्थता तरल-तरल चरण विभाजनको लागि अर्को संयन्त्र थप अनुसन्धानको योग्य सुझाव दिन्छ।सँगै लिएर, यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि PDPL ज्ञात BRD4 अन्तरक्रियाका साथै अज्ञात बाध्यकारी प्रोटीनहरू पहिचान गर्नको लागि एक आदर्श प्लेटफर्म हो।
miniSOG-मध्यस्थता BRD4 निकटता चिन्हको योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, एक्सपोजर समय: 2, 5, 10, र 20 मिनेट।b विभिन्न प्रकाश समयमा पहिचान गरिएका प्रोटीनहरूको ओभरल्याप।HEK293T-miniSOG-BRD4 मा पहिचान गरिएको प्रोटीन संवर्धन जंगली-प्रकार HEK293T को तुलनामा सांख्यिकीय रूपमा महत्त्वपूर्ण थियो।c निर्दिष्ट एक्सपोजर समयको समयमा लेबल नगरिएको प्रतिनिधि ज्ञात BRD4-बाइंडिंग प्रोटीनहरूको परिमाण गर्दा आयन तीव्रता।n = 3 जैविक रूपमा स्वतन्त्र नमूनाहरू।डेटा औसत ± मानक विचलनको रूपमा प्रस्तुत गरिन्छ।२-मिनेट समूहमा पहिचान गरिएका प्रोटिनहरूको जीन ओन्टोलॉजिकल विश्लेषण (GO)।पहिलो दस GO सर्तहरू सूचीबद्ध छन्।बबलहरू GO शब्द कोटि अनुसार रंगीन हुन्छन्, र बबल साइज प्रत्येक टर्ममा पाइने प्रोटिनहरूको संख्यासँग समानुपातिक हुन्छ।ई BRD4 सँग अन्तरक्रिया गर्ने प्रोटीनहरूको स्ट्रिङ विश्लेषण।पहेंलो सर्कलहरू प्रत्यक्ष गोंद हुन् र खैरो सर्कलहरू अप्रत्यक्ष गोंदको पहिलो तह हुन्।रातो रेखाहरूले प्रयोगात्मक रूपमा निर्धारित अन्तरक्रियाहरूलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ र नीलो रेखाहरूले पूर्वानुमानित अन्तरक्रियाहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ।f प्रतिनिधि BRD4 बाध्यकारी लक्ष्यहरू LC-MS/MS मा पहिचान गरिएको पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा प्रमाणित गरियो।g Co-immunoprecipitation प्रयोगहरूले SFPQ र BRD4 बीचको अन्तरक्रिया पुष्टि गर्दछ।यी प्रयोगहरू स्वतन्त्र रूपमा समान परिणामहरूका साथ कम्तिमा दुई पटक दोहोर्याइएको थियो।कच्चा डाटा कच्चा डाटा फाइल को रूप मा प्रदान गरिन्छ।
दर्ता नगरिएको POI-सम्बन्धित लक्ष्यहरू पहिचान गर्नका साथै, हामी परिकल्पना गर्छौं कि PDPL एन्जाइमहरूका लागि सब्सट्रेटहरू पहिचान गर्नका लागि उपयुक्त हुनेछ, जसलाई ठूला कम्प्लेक्सहरूमा अप्रत्यक्ष बाइन्डिङ प्रोटीनहरूको विशेषता अपरिचित सब्सट्रेटहरू एनोटेट गर्न आवश्यक पर्दछ।पार्किन (PARK2 द्वारा इन्कोड गरिएको) एक E3 ligase हो र पार्किनमा हुने उत्परिवर्तनले अटोसोमल रिसेसिभ जुभेनाइल पार्किन्सन रोग (AR-JP) 42 को कारण हो भनेर चिनिन्छ।थप रूपमा, पार्किनलाई mitophagy (mitochondrial autophagy) र प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरू हटाउन आवश्यक रूपमा वर्णन गरिएको छ।यद्यपि, धेरै पार्किन सब्सट्रेटहरू पहिचान गरिएको छ, यद्यपि यस रोगमा पार्किनको भूमिका अस्पष्ट छ।यसको अपरिचित सब्सट्रेटहरू एनोटेट गर्न, PDPL लाई पार्किनको N- वा C-टर्मिनसमा miniSOG थपेर परीक्षण गरिएको थियो।कोशिकाहरूलाई कार्बोनिल साइनाइड प्रोटोन ट्रान्सपोर्टर एम-क्लोरोफेनिलहाइड्राजोन (CCCP) द्वारा PINK1-पार्किन मार्ग मार्फत पार्किन सक्रिय गर्न उपचार गरिएको थियो।हाम्रो BRD4 PDPL नतिजाहरूको तुलनामा, पार्किन एन-टर्मिनस फ्युजनले लक्ष्य प्रोटीनहरूको ठूलो सेट प्रकट गर्‍यो, यद्यपि यसले C-टर्मिनसको ठूलो भाग (210 मध्ये 177) कभर गरेको छ (चित्र 5a, b र पूरक डेटा 4)।नतिजा रिपोर्ट संग संगत छ कि N-टर्मिनल ट्यागले पार्किन 44 लाई सक्रिय गर्न सक्छ।अचम्मको कुरा, Parkin43 का लागि प्रकाशित AP-MS नतिजाहरूको साथ हाम्रो डाटामा 18 ओभरल्यापिङ प्रोटीनहरू मात्र थिए, सम्भवतः सेल लाइनहरू र प्रोटोमिक्स कार्यप्रवाहहरू बीचको भिन्नताको कारणले।चार ज्ञात प्रोटीनहरू (ARDM1, HSPA8, PSMD14, र PSMC3) को अतिरिक्त दुई विधिहरू द्वारा पहिचान गरिएको (चित्र 5c) 43।LC-MS/MS को नतिजाहरू थप प्रमाणित गर्न, PDPL उपचार र त्यसपछिको पश्चिमी ब्लोटिंग HEK293T अभिभावक सेल परख र स्थिर एन-टर्मिनल पार्किन लाइनको परिणामहरू तुलना गर्न प्रयोग गरियो।पहिले अज्ञात लक्ष्यहरू CDK2, DUT, CTBP1, र PSMC4 एक ज्ञात बाइन्डर, DNAJB1 (चित्र 5d) सँग परीक्षण गरिएको थियो।
HEK293T कोशिकाहरूमा पार्किन-अन्तर्क्रिया गर्ने प्रोटिनहरूको ज्वालामुखी प्लट पार्किनको N- वा C-टर्मिनस (n = 3 स्वतन्त्र जैविक प्रयोगहरू) मा फ्युज गरिएको स्थिर रूपमा व्यक्त गरिएको miniSOG सँग।दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी-टेस्ट ज्वालामुखी प्लटहरूमा प्रयोग गरिएको थियो।HEK293T नकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो। महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन गरिएका प्रोटीनहरू रातो (p <0.05 र> 2-गुणा आयन तीव्रता भिन्नता) मा हाइलाइट गरिएका छन्। महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन गरिएका प्रोटीनहरू रातो (p <0.05 र> 2-गुणा आयन तीव्रता भिन्नता) मा हाइलाइट गरिएका छन्। Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов)। महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन गरिएका प्रोटिनहरू रातोमा हाइलाइट गरिएका छन् (p <0.05 र> आयन तीव्रतामा 2-गुणा भिन्नता)।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）।显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе)। महत्त्वपूर्ण रूपमा परिवर्तन गरिएका प्रोटिनहरू रातोमा हाइलाइट गरिएका छन् (p <0.05 र > आयनिक शक्तिमा 2-गुणा भिन्नता)।HEK293T-miniSOG का लागि महत्त्वपूर्ण तर HEK293T का लागि महत्त्वपूर्ण नभएका सम्बन्धित प्रोटीनहरू हरियो रंगमा देखाइएका छन्।b भेन रेखाचित्र एन-टर्मिनल र सी-टर्मिनल निर्माणहरू बीच ओभरल्यापिङ प्रोटीनहरू देखाउँदै।एन-टर्मिनल ट्यागहरूले पार्किनलाई अव्यवस्थित रूपमा सक्रिय गर्न सक्छ र अधिक चिन्न सकिने प्रोटीनहरूको परिणाम दिन्छ।c भेन रेखाचित्र PDPL र AP-MS बीच ओभरल्यापिङ प्रोटीनहरू देखाउँदै।ज्ञात अन्तरक्रियाकर्ताहरू सूचीबद्ध छन्, जसमा 18 ओभरल्यापिङ प्रोटीनहरू मध्ये 4 र PDPL मा विशेष रूपमा पहिचान गरिएका 159 प्रोटीनहरू मध्ये 11 समावेश छन्।d LC-MS/MS द्वारा पहिचान गरिएका प्रतिनिधि लक्ष्यहरू पश्चिमी ब्लटिङद्वारा प्रमाणित गरियो।e Ssu72 र SNW1 लाई दर्ता नगरिएको पार्किन सब्सट्रेटको रूपमा पहिचान गरिएको थियो।यी FLAG-ट्याग गरिएका प्रोटीन प्लाज्मिडहरू HEK293T र HEK293T-Parkin-miniSOG मा CCCP उपचार पछि विभिन्न समय बिन्दुहरूमा रूपान्तरण गरियो।पार्किन ओभरएक्सप्रेसन लाइनमा गिरावट अधिक स्पष्ट थियो।f प्रोटीसोम अवरोधक MG132 को प्रयोग गरेर, यो पुष्टि भयो कि Ssu72 र SNW1 को गिरावट प्रक्रिया प्रोटीसोम-सर्वभौमिकता द्वारा मध्यस्थता हो।यी प्रयोगहरू स्वतन्त्र रूपमा समान परिणामहरूका साथ कम्तिमा दुई पटक दोहोर्याइएको थियो।कच्चा डाटा कच्चा डाटा फाइल को रूप मा प्रदान गरिन्छ।
विशेष रूपमा, PDPL द्वारा पहिचान गरिएका प्रोटिनहरूले पार्किन-बाइन्डिङ प्रोटीनहरू र तिनीहरूको सब्सट्रेटहरू समावेश गर्नुपर्छ।दर्ता नगरिएको पार्किन सब्सट्रेटहरू पत्ता लगाउन हामीले सातवटा पहिचान गरिएका प्रोटिनहरू (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 र SNW1) र ट्रान्सफेक्टेड प्लाज्मिडहरूलाई यी जीनहरूलाई सामान्य HEK293T मा पर्दाफास गर्न र स्थिर रूपमा miniSOG-Parkin's293T3 को पालना गरेर miniSOG-Parkin's उपचार पछ्याउन चयन गर्यौं।Ssu72 र SNW1 प्रोटिनको स्तर स्थिर miniSOG-पार्किन लाइन (चित्र 5e) मा उल्लेखनीय रूपमा घटाइएको थियो।CCCP को साथ 12 घण्टाको उपचारले दुबै सब्सट्रेटहरूको सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण गिरावटको परिणाम दियो।Ssu72 र SNW1 को ह्रास प्रोटीसोम-व्यापकीकरण द्वारा विनियमित छ कि छैन भनेर अनुसन्धान गर्न, प्रोटीसोम अवरोधक MG132 प्रोटेजोम गतिविधिलाई रोक्न थपिएको थियो, र वास्तवमा हामीले पत्ता लगायौं कि तिनीहरूको गिरावट प्रक्रिया रोकिएको थियो (चित्र 5f)।अतिरिक्त गैर-सब्सट्रेट लक्ष्यहरू पश्चिमी ब्लोटिंग (पूरक चित्र 10) को प्रयोग गरेर पार्किन अन्तर्क्रियाकर्ताहरूको रूपमा पुष्टि गरियो, जसले LC-MS/MS सँग लगातार परिणामहरू देखाएको थियो।अन्तमा, लक्ष्य प्रोटीन ट्रान्सफेक्सन प्रमाणिकरणको साथ PDPL कार्यप्रवाहको एकीकरणले दर्ता नगरिएको E3 ligase सब्सट्रेटहरूको पहिचान गर्न अनुमति दिन्छ।
हामीले एक साझा निकटता चिन्ह लगाउने प्लेटफर्म विकास गरेका छौं जसले तपाईंलाई अन्तरिक्ष र समय अन्तरक्रिया गर्ने POIs पहिचान गर्न अनुमति दिन्छ।प्लेटफर्म miniSOG फोटोसेन्सिटाइजर प्रोटीनमा आधारित छ, जुन केवल 12 kDa हो, परिपक्व APEX2 इन्जाइम (27 kDa) को आधा भन्दा कम र TurboID (35 kDa) को एक तिहाइ आकार।सानो आकारले सानो प्रोटीन अन्तरक्रियात्मक अध्ययनको लागि अनुप्रयोगहरूको दायरा विस्तार गर्नुपर्छ।अतिरिक्त फोटोसेन्सिटाइजरहरूको थप अन्वेषण, चाहे आनुवंशिक रूपमा एन्कोड गरिएका प्रोटीनहरू वा साना अणुहरू, एकल अक्सिजनको क्वान्टम उपज बढाउन र यस दृष्टिकोणको संवेदनशीलता विस्तार गर्न आवश्यक छ।miniSOG को हालको संस्करणको लागि, निकटता मार्करहरू सक्रिय गर्न नीलो रोशनी प्रयोग गरेर उच्च अस्थायी रिजोलुसन प्राप्त गर्न सकिन्छ।थप रूपमा, लामो समयको एक्सपोजर समयले सिंगल अक्सिजनको ठूलो "क्लाउड" जारी गर्‍यो, जसको परिणामस्वरूप थप डिस्टल हिस्टिडाइन अवशेषहरू परिमार्जन भयो, लेबलिङको दायरा बढ्यो, र PDPL स्थानिय रिजोल्युसनलाई फाइन-ट्यून गर्ने क्षमता।हामीले संकेत-देखि-पृष्ठभूमि अनुपात बढाउनको लागि सात रासायनिक जाँचहरू पनि परीक्षण गर्‍यौं र यस दृष्टिकोण पछाडिको आणविक संयन्त्रको अन्वेषण गर्‍यौं।TOP-ABPP कार्यप्रवाहले निष्पक्ष खुला खोजको साथ संयोजन गरेको पुष्टि गर्‍यो कि परिमार्जनहरू हिस्टिडाइनहरूमा मात्र भएको थियो र लूप क्षेत्रमा हिस्टिडाइनहरूको लागि मध्यम प्राथमिकता बाहेक हिस्टिडाइन परिमार्जनहरूका लागि कुनै सुसंगत सूक्ष्म वातावरण अवलोकन गरिएको थिएन।
PDPL लाई प्रोटोम विशिष्टता र कम्तिमा अन्य निकटता लेबलिंग र अर्गानेल-विशिष्ट रासायनिक जाँच विधिहरूसँग तुलनात्मक रूपमा कभरेजको साथ सबसेलुलर प्रोटोमहरू विशेषता गर्न प्रयोग गरिएको छ।निकटता मार्करहरू पनि सफलतापूर्वक सतह, लाइसोसोमल, र सेक्रेटम-सम्बन्धित प्रोटोमहरू 46,47 को विशेषता गर्न प्रयोग गरिएको छ।हामी PDPL यी subcellular organelles संग उपयुक्त हुनेछ भन्ने विश्वास गर्छौं।थप रूपमा, हामीले PDPL लाई साइटोसोलिक प्रोटीन बाइन्डिङका लागि लक्ष्यहरू पहिचान गरेर चुनौती दियौं जुन तिनीहरूको गतिशील गुणहरू र थप अस्थायी अन्तरक्रियाहरूमा संलग्नताका कारण झिल्ली बाध्य प्रोटीनहरू भन्दा बढी जटिल छन्।PDPL दुई प्रोटीनहरूमा लागू गरिएको थियो, ट्रान्सक्रिप्शनल कोएक्टिभेटर BRD4 र रोग-सम्बन्धित ligase E3 पार्किन।यी दुई प्रोटीनहरू तिनीहरूको मौलिक जैविक कार्यहरूको लागि मात्र होइन, तर तिनीहरूको क्लिनिकल प्रासंगिकता र चिकित्सकीय क्षमताको लागि पनि छनौट गरिएको थियो।यी दुई POI को लागि, प्रसिद्ध बाध्यकारी साझेदारहरू र दर्ता नगरिएका लक्ष्यहरू पहिचान गरियो।विशेष रूपमा, चरण विभाजन-सम्बद्ध प्रोटीन SFPQ को-आईपी द्वारा पुष्टि गरिएको थियो, जसले BRD4 (छोटो आइसोफर्म) ले LLPS लाई नियमन गर्ने नयाँ संयन्त्रलाई संकेत गर्न सक्छ।एकै समयमा, हामी विश्वास गर्छौं कि पार्किन सब्सट्रेटहरूको पहिचान एक परिदृश्य हो जसमा अप्रत्यक्ष चिपकाउनेहरूको पहिचान आवश्यक छ।हामीले दुई अज्ञात पार्किन सब्सट्रेटहरू पहिचान गर्‍यौं र सर्वव्यापी-प्रोटीसोम मार्गमा तिनीहरूको गिरावट पुष्टि गर्‍यौं।भर्खरै, हाइड्रोलेज सब्सट्रेटहरूलाई इन्जाइमहरूसँग ट्र्याप गरेर पत्ता लगाउन संयन्त्र-आधारित ट्र्यापिङ रणनीति विकसित गरिएको छ।यद्यपि यो एक धेरै शक्तिशाली विधि हो, यो ठूला कम्प्लेक्सहरूको गठनमा संलग्न सब्सट्रेटहरूको विश्लेषणको लागि उपयुक्त छैन र इन्जाइम र सब्सट्रेट बीचको सहसंयोजक बन्धनको गठन आवश्यक छ।हामी आशा गर्छौं कि PDPL लाई अन्य प्रोटीन कम्प्लेक्स र इन्जाइम परिवारहरू, जस्तै deubiquitinase र metalloprotease परिवारहरू अध्ययन गर्न विस्तार गर्न सकिन्छ।
MiniSOG को नयाँ रूप, SOPP3 भनिन्छ, सुधारिएको सिंगल अक्सिजन उत्पादनको साथ विकसित गरिएको छ।हामीले miniSOG लाई SOPP3 सँग तुलना गर्यौं र सुधारिएको मार्किङ प्रदर्शन फेला पार्यौं, यद्यपि सिग्नल-टु-आवाज अनुपात अपरिवर्तित रह्यो (पूरक चित्र। 11)।हामीले परिकल्पना गर्यौं कि SOPP3 को अप्टिमाइजेसन (जस्तै, निर्देशित विकास मार्फत) ले अधिक कुशल फोटोसेन्सिटाइजर प्रोटीनहरू निम्त्याउनेछ जसलाई छोटो प्रकाश समय चाहिन्छ र यसैले थप गतिशील सेलुलर प्रक्रियाहरू क्याप्चर गर्न अनुमति दिन्छ।उल्लेखनीय रूपमा, PDPL को हालको संस्करण सेलुलर वातावरणमा सीमित छ किनभने यसलाई नीलो प्रकाशको प्रकाश चाहिन्छ र गहिरो तन्तुहरूमा प्रवेश गर्न सक्दैन।यो सुविधा पशु मोडेल अध्ययन मा यसको प्रयोग रोक्छ।यद्यपि, PDPL सँग ओप्टोजेनेटिक्सको संयोजनले विशेष गरी मस्तिष्कमा जनावर अनुसन्धानको लागि अवसर प्रदान गर्न सक्छ।थप रूपमा, अन्य इन्जिनियर इन्फ्रारेड फोटोसेन्सिटाइजरहरूले पनि यो सीमा हटाउँछन्।अहिले यस क्षेत्रमा अनुसन्धान भइरहेको छ ।
HEK293T सेल लाइन ATCC (CRL-3216) बाट प्राप्त गरिएको थियो।सेल लाइन माइकोप्लाज्मा संक्रमणको लागि नकारात्मक परीक्षण गरियो र DMEM (थर्मो, #C11995500BT) मा 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS, Vistech, #SE100-B) र 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (हाइक्लोन, #SV3001) को साथ पूरक थियो।मा हुर्कियो।
बिडेफार्मबाट ३-एमिनोफेनिलिन (नमूना ३) र (४-इथिनाइलफेनिल) मेथानामाइन (नमूना ४) खरिद गरिएको थियो।Propylamine (probe 2) ऊर्जा-रसायनबाट खरिद गरिएको थियो।N-(2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (probe 1) प्रकाशित विधिहरू अनुसार संश्लेषित गरिएको थियो।
पूरक तालिका 1 ले यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएका आनुवंशिक संरचनाहरूलाई सूचीबद्ध गर्दछ।miniSOG र KillerRed अनुक्रमहरू P. Zou (Peking University) बाट उपहार प्लाज्मिडबाट क्लोन गरिएको थियो।माइटोकोन्ड्रियल म्याट्रिक्स लक्ष्यीकरण अनुक्रम COX4 को 23 एन-टर्मिनल एमिनो एसिडबाट व्युत्पन्न गरिएको थियो र गिब्सन एसेम्बली (Beyotime, #D7010S) प्रयोग गरेर संकेतित भेक्टरहरूमा क्लोन गरिएको थियो।एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलमको झिल्ली र न्यूक्लियसलाई लक्षित गर्न, SEC61B मानव DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) HEK293T कोशिकाहरूको cDNA पुस्तकालयबाट PCR द्वारा प्रवर्धित, र H2B DNA (D. Lin, Banzhen द्वारा दान गरिएको)। र क्लोन गरिएको, माथि उल्लेख गरिए अनुसार।अन्यथा संकेत नगरेसम्म, स्थिर सेल लाइनहरूको ट्रान्सफेक्सन र निर्माणको लागि प्रयोग गरिने अन्य प्रोटीन जीनहरू HEK293T सेल cDNA पुस्तकालयबाट PCR एम्प्लीफाइड गरिएको थियो।G3S (GGGS) र G4S (GGGGS) चारा प्रोटीन र miniSOG बीच लिङ्करको रूपमा प्रयोग गरियो।यी फ्युजन निर्माणहरूमा V5 एपिटोप ट्याग (GKPIPNPLLGLDST) थपियो।स्तनधारी प्राणीहरूमा अभिव्यक्तिको लागि र स्थिर सेल लाइन स्थापना गर्न, miniSOG फ्युजन कन्स्ट्रक्टलाई pLX304 लेन्टिभाइरल भेक्टरमा सबक्लोन गरिएको थियो।ब्याक्टेरियल अभिव्यक्तिको लागि, miniSOG लाई C-टर्मिनसमा 6xHis लेबल गरिएको pET21a भेक्टरमा क्लोन गरिएको थियो।
HEK293T कोशिकाहरू प्रति कुवा 2.0 x 105 कोशिकाहरू छ-कुवा प्लेटहरूमा सीड गरिएको थियो र 24 घण्टा पछि पुन: संयोजक लेन्टिभाइरल प्लाज्मिडहरू (2.4 μg pLX304) र भाइरल प्याकेजिङ्ग प्लाज्मिडहरू (1.5 μg psPAX2 र 1.2 μg 1.2 μg 0.2 μg 1.2 μg 1.2 μg समय प्रयोग गरेर)। , #C0533), लगभग 80% फ्यूजन।रातभरि ट्रान्सफेक्सन पछि, माध्यम परिवर्तन गरियो र अर्को 24 घण्टाको लागि इन्क्युबेटेड।भाइरस सङ्कलन २४, ४८ र ७२ घण्टापछि गरिएको थियो ।लक्षित सेल लाइनहरूको संक्रमण हुनु अघि, भाइरल माध्यमलाई 0.8 μm फिल्टर (मर्क, #मिलेक्स-जीपी) मार्फत फिल्टर गरिएको थियो र 8 μg/ml को एकाग्रतामा polybrene (Solarbio, #H8761) थपिएको थियो।24 घण्टा पछि, कोशिकाहरूलाई माध्यम परिवर्तन गरेर रिकभर गर्न अनुमति दिइयो।कोशिकाहरू 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) को प्रयोग गरी कम कडा चयनको रूपमा पहिलो तीन खण्डहरूको लागि चयन गरिएको थियो।त्यसपछि 20 μg/ml अर्को तीन खण्डहरूको लागि थप कडा आहारको रूपमा प्रयोग गरियो।
कक्षहरू 12-कुवा कक्षहरू (Ibidi, #81201) मा लगभग 20,000 कक्षहरू प्रति कुवाको घनत्वमा रोपिएको थियो।HEK293T कोशिकाहरूको आसंजन सुधार गर्न, 50 µg/ml फाइब्रोनेक्टिन (कोर्निङ, #356008) फस्फेट बफर गरिएको सलाइन (PBS, Sangon, #B640435) मा 37°C मा पातलो पार्नुहोस्।कक्षहरू 1 घण्टाको लागि पूर्व-उपचार गरियो र त्यसपछि PBS को साथ हटाइयो।२४ घन्टा पछि, कोशिकाहरूलाई PBS बाट एक पटक धोइयो, ताजा ह्यान्क्सको सन्तुलित नुन घोल (HBSS, Gibco, #14025092) मा १ घन्टा ३७°C मा १ एमएम प्रोब ३ मा इन्क्युबेटेड, र त्यसपछि निलो एलईडी (४६० एनएम) सँग इन्क्युबेटेड )।कोठाको तापक्रममा १० मिनेटको लागि विकिरण गरिएको थियो।त्यस पछि, कक्षहरूलाई दुई पटक PBS द्वारा धोइयो र PBS (Sangon, #E672002) मा 4% formaldehyde को साथ 15 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा फिक्स गरियो।PBS को साथ तीन पटक धोएर फिक्स्ड सेलहरूबाट अतिरिक्त फॉर्मल्डिहाइड हटाइयो।त्यसपछि कोशिकाहरूलाई PBS मा 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) का साथ पारगम्य बनाइयो र PBS सँग 3 पटक धोइयो।त्यसपछि च्याम्बर हटाउनुहोस् र प्रत्येक नमूनामा 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) समावेश भएको क्लिक प्रतिक्रिया मिश्रणको 25 μl थप्नुहोस्। र 0.5 mg/ml सोडियम एस्कर्बेट (अलादीन, नम्बर S105024) र कोठाको तापक्रममा 30 मिनेटको लागि इन्क्युबेटेड।स्न्याप प्रतिक्रिया पछि, कक्षहरू 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) भएको PBS सँग छ पटक धोइयो र त्यसपछि कोठाको तापमानमा 30 मिनेटको लागि PBST मा 5% BSA (Abcone, #B24726) को साथ ब्लक गरियो।
कोलोकलाइजेशन इम्युनोस्टेनिङका लागि, संकेत गरिएका सर्तहरू अनुसार कोशिकाहरूलाई प्राथमिक एन्टिबडीहरूसँग इन्क्युबेटेड गरिएको थियो: माउस एन्टी-V5 ट्याग mAb (1:500, CST, #80076), खरगोश एन्टि-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), खरगोश पोलीक्लोनल एन्टि-क्याल्नेक्सिन एन्टिबडी (1:500, Abcam, #ab22595) वा खरगोश एन्टि-ल्यामिन A/C मोनोक्लोनल एन्टिबडी (1:500; CST, #2032) रातभर 4 °C मा।PBST बाट ३ पटक धोएपछि, कोशिकाहरू माध्यमिक एन्टिबडीहरूद्वारा इन्क्युबेटेड थिए: बाख्रा एन्टी-रेबिट एलेक्सा फ्लोर ४८८ (थर्मो, #A11034) 1:1000 पातलो, बाख्रा एन्टी-माउस एलेक्सा फ्लोर 594 (CST, #8889) 1:100 पातलो।पातलो 30 मिनेटको लागि कोठाको तापमानमा पतला।त्यसपछि कक्षहरूलाई PBST ले ३ पटक धोइयो र कोठाको तापक्रममा १० मिनेटको लागि PBS मा DAPI (थर्मो, #D1306) काउन्टरस्टेन गरियो।PBS सँग 3 वटा धुने पछि, कोशिकाहरूलाई 50% ग्लिसरोल (Sangon, #A600232) मा PBS मा इमेजिङको लागि सिल गरिएको थियो।इम्युनोफ्लोरोसेन्ट छविहरू ZEISS LSM 900 Airyscan2 कन्फोकल माइक्रोस्कोप र ZNE 3.5 सफ्टवेयर प्रयोग गरेर प्राप्त गरियो।
सिंगल अक्सिजन फ्लोरोसेन्ट इमेजिङको लागि, ह्याक्स HEPES बफर (DOJINDO, #MT05) मा 100 nM Si-DMA थप्नु अघि ह्यान्क्स HEPES बफरसँग कक्षहरू दुई पटक धोइयो।प्रकाशको सम्पर्कमा आएपछि, कोशिकाहरूलाई 45 मिनेटको लागि 37 डिग्री सेल्सियसमा CO2 इन्क्यूबेटरमा इन्क्युबेट गरिएको थियो।त्यसपछि कक्षहरूलाई ह्यान्क्सको HEPES बफरसँग दुई पटक धोइयो र ह्यान्क्सको HEPES बफरमा Hoechst सँग कोठाको तापक्रममा १० मिनेटको लागि काउन्टरस्टेन गरियो र ZEISS LSM 900 कन्फोकल माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर दृश्य बनाइयो।, #M36008) क्याल्सियम र म्याग्नेसियम युक्त HBSS बफरमा।प्रकाश वा डोक्सोरुबिसिन (MCE, #HY-15142A) को सम्पर्कमा आएपछि, कोशिकाहरूलाई CO2 इन्क्यूबेटरमा ३७° C. मा १० मिनेटसम्म इन्क्युबेटेड गरियो, HBSS बफरले दुई पटक धोइयो, र HBSS बफरमा Hoechst सँग कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेटेड गरियो।मिनेट।डोक्सोरुबिसिनलाई सकारात्मक जाँच नियन्त्रणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो जहाँ कोशिकाहरूलाई HBSS मा 20 μM doxorubicin 30 मिनेटको लागि 1% BSA समावेश गरी उपचार गरिएको थियो।इम्युनोफ्लोरोसेन्ट छविहरू Zeiss LSM 900 कन्फोकल माइक्रोस्कोप प्रयोग गरेर प्राप्त गरियो।
HEK293T कोशिकाहरू स्थिर रूपमा mito-miniSOG व्यक्त गर्ने 15 सेमी भाँडामा लगभग 30% को घनत्वमा बीज गरिएको थियो।४८ घन्टा पछि, ~८०% संगम पुगेपछि, कक्षहरूलाई PBS सँग एक पटक धोइयो, ताजा HBSS बफरमा १ एमएम प्रोब ३ सँग ३७ डिग्री सेल्सियसमा १ घण्टाको लागि इन्क्युबेटेड र त्यसपछि कोठामा १० मिनेटको लागि निलो एलईडीले उज्यालो पारियो। तापमान।।त्यसपछि, कक्षहरू PBS सँग दुई पटक धोइयो, स्क्र्याप गरियो र EDTA-मुक्त प्रोटीज अवरोधकहरू (MCE, #HY-K0011) युक्त आइस-कोल्ड PBS बफरमा पुन: निलम्बन गरियो।1 मिनेट (35% एम्प्लिच्युडमा 1 सेकेन्ड अन र 1 सेकेन्ड अफ) को लागि टिप sonicating द्वारा सेलहरू लाइज गरियो।परिणामस्वरूप मिश्रण 15,871 xg मा 10 मिनेटको लागि 4°C मा फोहोर हटाउनको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो, र BCA प्रोटीन परख किट (Beyotime, #P0009) को प्रयोग गरेर सुपरनेटेन्ट एकाग्रता 4 mg/mL मा समायोजन गरियो।माथिको 1 ml lysate लाई 0.1 mM फोटोडिग्रेडेबल बायोटिन एजाइड (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), र तल 1 mM Cuubator सँग मिलाउनुहोस्। कोठाको तापमानमा 1 घण्टाको लागि घुमाउनुहोस्।स्न्याप प्रतिक्रिया पछि, मिश्रणलाई 10 मिलीलीटर गिलासको शीशीमा पूर्व-मिश्रित समाधान (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) मा थप्नुहोस्।नमूनाहरू मिश्रित थिए र कोठाको तापक्रममा 10 मिनेटको लागि 4500 ग्राम मा केन्द्रित गरियो।तल्लो र माथिल्लो समाधानहरू खारेज गरियो, अवक्षेपणलाई 1 मिलीलीटर मिथानोलले दुई पटक धोइयो र 4 डिग्री सेल्सियसमा 5 मिनेटको लागि 15871×g मा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो।अवक्षेपण विघटन गर्न 25 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (ABC, Aladdin, no. A110539) मा 8 एम यूरिया (अलादीन, नम्बर U111902) को 1 एमएल थप्नुहोस्।नमूनाहरू 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) को साथ 40 मिनेटको लागि 55°C मा 15 mM ताजा iodoacetamide (Sangon, #A600539) थपेर अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा पुनर्गठन गरियो।30 मिनेट भित्र अल्किलेसन।।प्रतिक्रिया रोक्नको लागि थप 5 एमएम डिथियोथ्रिटोल थपियो।प्रत्येक नमूनाको लागि लगभग 100 μl NeutrAvidin agarose मोती (Thermo, #29202) 1 ml PBS को साथ 3 पटक धोएर तयार गर्नुहोस्।माथिको प्रोटोम घोललाई 5 एमएल पीबीएसले पातलो पारिएको थियो र कोठाको तापक्रममा 4 घण्टाको लागि पूर्व-धोइएका न्युट्राएभिडिन एगारोज मोतीले इन्क्युबेटेड गरियो।त्यसपछि मोतीहरू 0.2% SDS (Sangon, #A600485) भएको 5 ml PBS संग 3 पटक, 1M युरिया भएको 5 ml PBS संग 3 पटक, र 5 ml ddH2O संग 3 पटक धोइयो।त्यसपछि मोतीहरू सेन्ट्रीफ्युगेशनद्वारा काटियो र 200 μl 25 mM ABC मा 1 M यूरिया, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) र 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280) समावेश गरियो।रोटेशनको साथ 37 डिग्री सेल्सियसमा रातभर ट्रिप्सिनाइज गर्नुहोस्।pH 2-3 नपुगेसम्म फॉर्मिक एसिड (थर्मो, # A117-50) थपेर प्रतिक्रिया रोकियो।मोतीहरू ०.२% एसडीएस भएको १ एमएल पीबीएसले ३ पटक, १ एम युरिया भएको १ एमएल पीबीएसले ३ पटक र १ मिलि डिस्टिल्ड वाटरले ३ पटक धोइयो।परिमार्जित पेप्टाइडहरू 70% MeOH को 200 μl प्रयोग गरेर 90 मिनेटको लागि प्रकाश lysis (365 nm) द्वारा जारी गरिएको थियो।सेन्ट्रीफ्यूगेशन पछि, सुपरनेटेन्ट सङ्कलन गरियो।त्यसपछि मोतीहरू 70% MeOH को 100 μl सँग एक पटक धोइयो र सुपरनेटेन्टहरू जम्मा गरियो।नमूनाहरू स्पीडभ्याक भ्याकुम कन्सेन्ट्रेटरमा सुकाइयो र विश्लेषण नभएसम्म -20 डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गरियो।
एकल अक्सिजन परिमार्जित पेप्टाइडहरू पहिचान गर्न र परिमाण गर्न, नमूनाहरू 0.1% फर्मिक एसिडमा पुन: घुलनशील थिए र विक्रेता सफ्टवेयरबाट Tune र Xcalibur बाट न्यानो ESI स्रोतसँग सुसज्जित Orbitrap Fusion Lumos Tribrid मास स्पेक्ट्रोमिटर प्रयोग गरेर 1 μg पेप्टाइडहरू विश्लेषण गरियो।नमूनाहरू 75 µm × 15 सेमी आन्तरिक रूपमा प्याक गरिएको केशिका स्तम्भमा 3 µm C18 सामग्री (ReproSil-pur, #r13.b9.) सँग अलग गरिएको थियो र EASY-nLC 1200 UHPLC प्रणाली (थर्मो) मा जडान गरिएको थियो।पेप्टाइडहरू रैखिक 95 मिनेट ढाँचा क्रोमेटोग्राफी द्वारा 8% विलायक B बाट 50% विलायक B (पानीमा A = 0.1% फॉर्मिक एसिड, 80% एसीटोनिट्रिलमा B = 0.1% फॉर्मिक एसिड), त्यसपछि रैखिक रूपमा 98% B मिनेटमा बढाइयो। ६ मिनेटमा ३०० एनएल/मिनेटको प्रवाह दरमा।Orbitrap Fusion Lumos ले डेटाको आधारमा पूर्ण MS स्क्यान र MS2 स्क्यान बीच वैकल्पिक रूपमा डेटा सङ्कलन गर्दछ।स्पटरिङ भोल्टेज 2.1 kV मा सेट गरिएको थियो र आयन यातायात केशिकाको तापमान 320 डिग्री सेल्सियस थियो।MS स्पेक्ट्रा (350-2000 m/z) 120,000, AGC 4 × 105, र 150 ms को अधिकतम इनपुट समयको साथ सङ्कलन गरिएको थियो।प्रत्येक पूर्ण स्क्यानमा 10 सबैभन्दा सामान्य गुणन चार्ज गरिएको पूर्ववर्तीहरू 30% को सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा, 1.6 m/z को एक क्वाड्रपोल आइसोलेशन विन्डो, र 30,000 को रिजोल्युसन सेटिङको साथ HCD को प्रयोग गरेर खण्डित गरियो।5×104 र अधिकतम इनपुट समय 150 ms प्रयोग गरेर टेन्डम मास स्पेक्ट्रोमेट्रीको लागि AGC लक्ष्य।गतिशील अपवाद ३० सेकेन्डमा सेट गरिएको छ। असाइन नगरिएका आयनहरू वा 1+ र >7+ को चार्ज भएका MS/MS को लागि अस्वीकार गरियो। असाइन नगरिएका आयनहरू वा 1+ र >7+ को चार्ज भएका MS/MS को लागि अस्वीकार गरियो। Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ र >7+ были отклонены для МС/МС। 1+ र > 7+ को चार्ज संग अनअसाइन गरिएको आयनहरू वा आयनहरू MS/MS को लागि अस्वीकार गरियो।未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS।未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS। Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ र >7+ были отклонены для МС/МС। 1+ र > 7+ को चार्ज भएका अनिर्दिष्ट आयनहरू वा आयनहरू MS/MS को लागि अस्वीकार गरियो।
कच्चा डाटा MSFragger मा आधारित FragPipe कम्प्युटिङ प्लेटफर्म प्रयोग गरी प्रशोधन गरिन्छ।मास पूर्वाग्रहहरू र सम्बन्धित एमिनो एसिडहरू -150 देखि 500 ​​Da को पूर्ववर्ती जन सहिष्णुताको साथ खुला खोज एल्गोरिदम प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।परिमार्जित पेप्टाइडहरू त्यसपछि हिस्टिडाइन परिमार्जनहरू प्रयोग गरी पहिचान गरियो जसमा PD मा +२२९.०९६४ र +२४७.१०६९ डा (प्रोटिओम डिस्कवरर २.५, थर्मो) मास प्राप्त भयो।
फ्युज गरिएको miniSOG जीनलाई स्थिर रूपमा व्यक्त गर्ने कक्षहरूलाई 6 सेन्टीमिटरको भाँडोमा राखिएको थियो।~80% संगममा पुगेपछि, कोशिकाहरूलाई HBSS (Gibco, #14025092) सँग एक पटक धोइयो, त्यसपछि HBSS मा रासायनिक प्रोबहरू 1 घण्टाको लागि 37°C मा इन्क्युबेटेड र नीलो प्रकाशले उज्यालो गरियो।कोठाको तापक्रममा २० मिनेटको लागि १०W एलईडी।PDPL मा कुन प्रकारको प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरू समावेश छन् भनेर निर्धारण गर्न, 0.5 mM भिटामिन C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (सिग्मा, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (ऊर्जा केमिकल, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 कोषहरूमा पूरकको रूपमा थपियो।चिसो PBS संग धोए पछि, कोशिकाहरू स्क्र्याप गरियो, 1.5 ml सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरूमा सङ्कलन गरियो, र EDTA बिना 1x प्रोटीज अवरोधकको साथ PBS को 200 μl मा 1 मिनेटको लागि टिपको साथ sonicated (1 s र 1 s बिना, आयाम 35%)।नतिजा मिश्रणलाई 15,871 × g मा 10 मिनेटको लागि 4 °C मा सेन्ट्रीफ्यूज गरिएको थियो र बीसीए प्रोटीन परख किट प्रयोग गरेर सुपरनेटेन्ट एकाग्रता 1 mg/mL मा समायोजन गरियो।माथिको lysate को लगभग 50 μl 0.1 mM रोडामाइन अजाइड (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, र 1 mM CuSO4 कोठाको तापक्रममा 1 घण्टाको लागि तलबाट माथि घुमाएर इन्क्युबेटेड गरिएको थियो।क्लिक प्रतिक्रिया पछि, नमूनाहरूमा 250 μl प्रि-चिल्ड एसीटोन थपेर, -20°C मा 20 मिनेटको लागि इन्क्युबेट गरेर र 4°C मा 10 मिनेटको लागि 6010×g मा सेन्ट्रीफ्यूज गरेर एसीटोनको साथ वर्षा गरियो।गोली सङ्कलन गर्नुहोस् र 50 μl 1x Laemmli को बफरमा 10 मिनेटको लागि 95 डिग्री सेल्सियसमा उमाल्नुहोस्।नमूनाहरू त्यसपछि SDS-PAGE लामो जेलहरूमा विश्लेषण गरियो र छवि ल्याब टच सफ्टवेयरको साथ Bio-rad ChemiDoc MP टच इमेजिङ प्रणाली प्रयोग गरी कल्पना गरियो।
पुन: संयोजक miniSOG-6xHis प्रोटीन को अभिव्यक्ति र शुद्धीकरण पहिले वर्णन गरिए अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो।संक्षेपमा, E. coli BL21(DE3) कोशिकाहरू (TransGen, #CD701-02) लाई pET21a-miniSOG-6xHis सँग रूपान्तरण गरिएको थियो र प्रोटीन अभिव्यक्ति 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) को साथ प्रेरित गरिएको थियो।सेल लाइसिस पछि, प्रोटिनहरू Ni-NTA agarose मोती (MCE, no. 70666) को प्रयोग गरेर शुद्ध गरियो, PBS विरुद्ध डायलाइज गरियो, र -80°C मा भण्डारण गरियो।
एन्टिबडी-आधारित इन भिट्रो लेबल प्रोक्सिमिटी परखको लागि, 100 μM शुद्ध miniSOG, 1 mM प्रोब 3, र 1 μg एन्टि-लेबल माउस मोनोक्लोनल एन्टिबडी (TransGen, #HT501-01) PBS मा 50 μl को कुल प्रतिक्रिया मात्रामा मिलाउनुहोस्।।प्रतिक्रिया मिश्रण कोठाको तापक्रममा 0, 2, 5, 10, र 20 मिनेटको लागि नीलो एलईडी प्रकाशको साथ विकिरण गरिएको थियो।मिश्रणलाई ०.१ एमएम बायोटिन-पीईजी३-अजाइड (अलादीन, #B122225), १ एमएम टीसीईपी, ०.१ एमएम टीबीटीए लिगान्ड, र १ एमएम CuSO4 कोठाको तापक्रममा १ घन्टाको लागि अपवर्ड मोशन शेकरमा इन्क्युबेटेड गरिएको थियो।स्न्याप प्रतिक्रिया पछि, मिश्रणमा सीधा 4x Laemmli को बफर थप्नुहोस् र 95 डिग्री सेल्सियसमा 10 मिनेटको लागि उमाल्नुहोस्।नमूनाहरू SDS-PAGE gels मा विश्लेषण गरियो र streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) को साथ पश्चिमी ब्लटिंग द्वारा विश्लेषण गरियो।
सी-टर्मिनल एमिडेशन (LHDALDAK-CONH2) सँग हिस्टिडाइन युक्त सिंथेटिक पेप्टाइड नजिकैको पेप्टाइड-आधारित इन भिट्रो लेबलिङको विश्लेषण गर्न प्रयोग गरिएको थियो।यस परखमा, 100 μM शुद्ध miniSOG, 10 mM प्रोब 3 र 2 μg/ml सिंथेटिक पेप्टाइड PBS मा 50 μl को कुल प्रतिक्रिया मात्रामा मिसाइएको थियो।प्रतिक्रिया मिश्रण कोठाको तापक्रममा १ घण्टाको लागि नीलो एलईडी बत्तीको साथ विकिरण गरिएको थियो।नमूनाको एक माइक्रोलिटरलाई LC-MS प्रणाली (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight MassLynx स्पेक्ट्रम विश्लेषण सफ्टवेयरको साथ मास स्पेक्ट्रोमिटर) प्रयोग गरेर विश्लेषण गरिएको थियो।
HEK293T कोशिकाहरूलाई स्थिर रूपमा miniSOG फ्युजन जीन अभिव्यक्त गर्ने 10 सेन्टीमिटरको भाँडामा बिभिन्न अर्गानेल स्थानीयकरण (Mito, ER, न्यूक्लियस) र पार्किन-miniSOG र BRD4-miniSOG लाइनहरूका लागि 15 सेन्टीमिटर भाँडाहरूमा सीड गरिएको थियो।~90% संगममा पुगेपछि, कक्षहरू HBSS सँग एक पटक धोइयो, त्यसपछि HBSS मा प्रोब 3 सँग 37 ​​डिग्री सेल्सियसमा 1 घण्टाको लागि इन्क्युबेटेड र कोठाको तापक्रममा 10 W नीलो एलईडीसँग उज्यालो गरियो।पार्किनको गैर-सम्पर्क लेबलिङको लागि, HBSS मा प्रोब 3 सहित 10 µM प्रोटोन कार्बोनिल साइनाइड वाहक m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) 1 घण्टाको लागि 37°C मा थपियो।सेल लाइसिस, क्लिक केमिस्ट्री, रिडक्शन र एल्किलेसन चरणहरू माथि वर्णन गरिए जस्तै थिए, बाहेक 2 मिलीग्राम लाइसेट थपिएको थियो र फोटोडिग्रेडेबल बायोटिन अजाइडको सट्टा क्लिक प्रतिक्रियामा बायोटिन PEG3 अजाइड प्रयोग गरिएको थियो।संवर्धन पछि, मोतीहरू 0.2% एसडीएस भएको 5 एमएल पीबीएसले 3 पटक, 1 एम यूरिया भएको 5 एमएल पीबीएसले 3 पटक र 5 एमएल पीबीएसले 3 पटक धोइयो।त्यसपछि, 2 µg ट्रिप्सिन 300 µl 25 mM ABC मा थपियो जसमा 1 M यूरिया भएको प्रोटिनलाई 37 डिग्री सेल्सियसमा रातभरि क्लीभ गरियो।2-3 को pH नपुगेसम्म फॉर्मिक एसिड थपेर प्रतिक्रिया रोकियो।मोतीहरूमा ट्रिप्सिनाइजेसन पछि, पेप्टाइड घोललाई SOLAµ HRP स्तम्भ (थर्मो, #60209-001) प्रयोग गरेर डिसल्ट गरियो र स्पीडभ्याक भ्याकुम कन्सेन्ट्रेटरमा सुकाइयो।पेप्टाइडहरू ०.१% फर्मिक एसिडमा पुन: घुलनशील थिए र माथि वर्णन गरिएको नानो-ईएसआई स्रोतसँग सुसज्जित अर्बिट्राप फ्यूजन लुमोस ट्राइब्रिड मास स्पेक्ट्रोमिटर प्रयोग गरेर 500 एनजी पेप्टाइडहरू विश्लेषण गरियो।पेप्टाइडहरू व्यापारिक RP-HPLC प्रिकोलमहरू (75 μm x 2 cm) (थर्मो, no. 164946) र विश्लेषणात्मक RP-HPLC स्तम्भहरू (75 μm x 25 सेमी) (थर्मो, नम्बर 164941) मा अलग गरिएको थियो, दुबै 2 μm भरिएको थियो।60 मिनेटमा 8% देखि 35% ACN सम्मको ग्रेडियन्ट, त्यसपछि 300 Nl/min को प्रवाह दरमा 6 मिनेटमा रेखीय रूपमा 98% B मा बढ्यो।MS स्पेक्ट्रा (350-1500 m/z) 60,000, AGC 4 × 105, र 50 ms को अधिकतम इनपुट समयको साथ सङ्कलन गरिएको थियो।30% को सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा, 1.6 m/z को एक क्वाड्रपोल आइसोलेसन विन्डो, र 15000 को एक रिजोल्युसनको साथ 3 s चक्रहरूमा HCD द्वारा चयन गरिएका आयनहरू क्रमिक रूपमा खण्डित थिए। एक 5 × 104 ट्यान्डम मास स्पेक्ट्रोमीटर AGC लक्ष्य र अधिकतम इंजेक्शन समय 22 ms को प्रयोग गरियो।गतिशील बहिष्कार 45 सेकेन्डमा सेट गरिएको छ। असाइन नगरिएका आयनहरू वा 1+ र >7+ को चार्ज भएका MS/MS को लागि अस्वीकार गरियो। असाइन नगरिएका आयनहरू वा 1+ र >7+ को चार्ज भएका MS/MS को लागि अस्वीकार गरियो। Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ र >7+ были отклонены для МС/МС। 1+ र > 7+ को चार्ज संग अनअसाइन गरिएको आयनहरू वा आयनहरू MS/MS को लागि अस्वीकार गरियो।未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS।未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS। Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ र >7+ были отклонены для МС/МС। 1+ र > 7+ को चार्ज भएका अनिर्दिष्ट आयनहरू वा आयनहरू MS/MS को लागि अस्वीकार गरियो।
NeutrAvidin मोतीको संवर्धन सम्मको नमूना तयारी चरणहरू माथि वर्णन गरिएको LC-MS/MS विश्लेषणमा जस्तै थिए।लगभग 50 μg lysate लाई लोडिङ नियन्त्रणको लागि इनपुटको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो र 2 mg lysate क्लिक प्रतिक्रियाहरूको लागि प्रयोग गरिएको थियो।न्युट्राभिडिनसँग संवर्द्धन र धोएपछि, एगारोज रेजिन मोतीमा ५० μl लेम्म्लीको बफर थपेर र ९५ डिग्री सेल्सियसमा ५ मिनेट उमालेर बाँधिएका प्रोटिनहरू हटाइयो।नियन्त्रण लोड इनपुट र मनका समृद्ध नमूनाहरू SDS-PAGE द्वारा विश्लेषण गरियो र मानक पश्चिमी ब्लट विधिहरूद्वारा PVDF झिल्ली (Millipore, #ISEQ00010) मा हस्तान्तरण गरियो।झिल्लीहरू 5% स्किम मिल्क (Sangon, #A600669) TBS मा 0.1% tween-20 (TBST) भएको र प्राथमिक र माध्यमिक एन्टिबडीहरूसँग क्रमशः इन्क्युबेटेड थिए।TBST मा 5% स्किम मिल्कमा प्राथमिक एन्टिबडीहरू 1:1000 पातलो पारियो र रातभर 4° सेन्टिग्रेडमा इन्क्युबेटेड गरियो।माध्यमिक एन्टिबडीहरू 1:5000 को अनुपातमा प्रयोग गरियो र कोठाको तापक्रममा 1 घण्टासम्म इन्क्युबेटेड गरियो।केमिडोक एमपी इमेजिङ प्रणालीको प्रयोग गरेर केमिल्युमिनेसेन्सद्वारा झिल्लीहरू भिजुअलाइज गरिएको थियो।चित्रमा ब्लट र जेलका सबै अनकट स्क्यानहरू कच्चा डाटाको रूपमा प्रस्तुत गरिएका छन्।
यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएको प्राथमिक एन्टिबडीहरूमा खरगोश एन्टि-SFPQ मोनोक्लोनल एन्टिबडी (CST, नम्बर 71992), खरगोश एन्टि-FUS मोनोक्लोनल एन्टिबडी (CST, नम्बर 67840), खरायो एन्टि-NSUN2 पोलीक्लोनल एन्टिबडी (प्रोटिनटेक, नम्बर 20854-1-) समावेश थियो। AP), खरायो एन्टि-mSin3A पोलीक्लोनल एन्टिबडी (Abcam, #ab3479), माउस एन्टि-ट्याग मोनोक्लोनल एन्टिबडी (TransGen, #HT201-02), माउस एन्टी-β-actin मोनोक्लोनल एन्टिबडी (TransGen, #HC201-01), खरायो एन्टिबडी -CDK2 मोनोक्लोनल एन्टिबडी (ABclonal, #A0094), खरायो मोनोक्लोनल एन्टिबडी to CTBP1 (ABclonal, #A11600), खरायो पॉलीक्लोनल एन्टिबडी to DUT (ABclonal, #A2901), खरायो पॉलीक्लोनल एन्टिबडी PSMC4 (ABclonal, #A2505), DNAJB1 पोलीक्लोनल एन्टिबडी (ABclonal, # A5504)।यी एन्टिबडीहरू TBST मा 5% स्किम मिल्कमा 1:1000 कमजोरीमा प्रयोग गरियो।यस अध्ययनमा प्रयोग गरिएको माध्यमिक एन्टिबडीहरूमा एन्टि-रेबिट IgG (TransGen, #HS101-01), एन्टी-माउस IgG (TransGen, #HS201-01) 1:5000 डिल्युसन समावेश थियो।
BRD4 SFPQ सँग अन्तर्क्रिया गर्छ कि गर्दैन भनेर थप अनुसन्धान गर्न, स्थिर HEK293T र BRD4-miniSOG सेलहरू ओभरएक्सप्रेस गर्ने HEK293T 10 सेन्टीमिटरको भाँडामा राखिएको थियो।कोशिकाहरूलाई चिसो पीबीएसले धोइयो र 1 एमएल पियर्स आईपी लिसिस बफर (थर्मो फिशर, #87787) मा EDTA-मुक्त प्रोटीज अवरोधकको साथ 4°C मा 30 मिनेटको लागि लिजियो।त्यस पछि, 1.5 मिलीलीटर सेन्ट्रीफ्यूज ट्युबहरूमा लाइसेटहरू सङ्कलन गरियो र 4 डिग्री सेल्सियसमा 10 मिनेटको लागि 15,871 xg मा सेन्ट्रीफ्यूज गरियो।सुपरनेटेन्टलाई 5 µg एन्टि-V5 लेबल गरिएको माउस मोनोक्लोनल एन्टिबडी (CST, #80076) का साथ रातभर ४ डिग्री सेल्सियसमा काटिएको थियो।लगभग 50 μl प्रोटीन A/G चुम्बकीय मोती (MCE, #HY-K0202) को ०.५% Tween-20 भएको PBS सँग दुई पटक धुनुहोस्।त्यसपछि सेल लाइसेटहरूलाई चुम्बकीय मोतीहरूद्वारा ४ घण्टासम्म ४ डिग्री सेल्सियसमा तलदेखि माथिसम्म घुमाएर इन्क्युबेटेड गरियो।त्यसपछि मोतीहरूलाई 1 मिलीलीटर PBST बफरले चार पटक धोइयो र 95 डिग्री सेल्सियसमा 5 मिनेटको लागि उमालियो।नमूनाहरू SDS-PAGE gels मा विश्लेषण गरियो र मानक पश्चिमी ब्लट विधिहरू प्रयोग गरेर PVDF झिल्लीहरूमा हस्तान्तरण गरियो।TBST मा 5% स्किम मिल्कमा झिल्लीहरू अवरुद्ध थिए र प्राथमिक र माध्यमिक एन्टिबडीहरूको साथ क्रमशः इन्क्युबेटेड थिए।प्राइमरी एन्टिबडी र्याबिट एन्टि-SFPQ मोनोक्लोनल एन्टिबडी (CST, #71992) TBST मा 5% स्किम मिल्कमा 1:1000 को अनुपातमा प्रयोग गरियो र 4°C मा रातभर इन्क्युबेटेड गरियो।एन्टि-रेबिट आईजीजी १:५००० को अनुपातमा प्रयोग गरियो र कोठाको तापक्रममा १ घण्टासम्म इन्क्युबेटेड गरियो।केमिडोक एमपी इमेजिङ प्रणालीको प्रयोग गरेर केमिल्युमिनेसेन्सद्वारा झिल्लीहरू भिजुअलाइज गरिएको थियो।
सॉल्भेन्ट एक्सेसिबल सर्फेस एरिया (SASA) विश्लेषणको लागि प्रयोग गरिएका सबै संरचनाहरू प्रोटीन डाटा बैंक (PDB) 52 वा AlphaFold प्रोटीन संरचना डाटाबेस 53 बाट प्राप्त गरिएका थिए।FreeSASA कार्यक्रम प्रयोग गरी प्रत्येक अवशेषको लागि निरपेक्ष SASA गणना गरिएको थियो।लेबल गरिएको हिस्टिडाइन र यसका छिमेकीहरूको लागि मात्र पूर्ण र अस्पष्ट SASA डाटा प्रत्येक संरचनाको लागि औसत SASA प्राप्त गर्न प्रयोग गरियो।प्रत्येक हिस्टिडाइनको लागि सापेक्ष विलायक पहुँच (RSA) विलायकमा उपलब्ध अनुभवजन्य अधिकतम सम्भावित अवशेष सतह क्षेत्रद्वारा निरपेक्ष SASA मान विभाजित गरेर गणना गरिएको थियो।सबै हिस्टिडाइनहरू लुकेको रूपमा वर्गीकृत गरियो यदि औसत RSA 20% भन्दा कम थियो, अन्यथा खुलासा56।
DDA मोडमा प्राप्त कच्चा फाइलहरू Proteome Discoverer (v2.5) वा MSfragger (Fragpipe v15.0) प्रयोग गरी उपयुक्त SwissProt प्रमाणित प्रोटीन डाटाबेसमा सामान्य दूषित पदार्थहरू समावेश गरी खोजी गरियो।पेप्टाइडहरूलाई दुई हराइरहेको क्लीभेज साइटहरू सहित पूर्ण ट्रिप्सिन आवश्यक थियो, एक निश्चित परिमार्जनको रूपमा कार्बामोइल मेथिलेसन र गतिशील परिमार्जनको रूपमा मेथियोनाइन अक्सिडेशन।अग्रसर र टुक्रा वजन सहिष्णुता क्रमशः 10 ppm र 0.02 Da (MS2 Orbitrap) मा सेट गरिएको थियो। दूषित हिटहरू हटाइयो, र <1% को गलत खोज दर प्राप्त गर्न प्रोटीनहरू फिल्टर गरियो। दूषित हिटहरू हटाइयो, र <1% को गलत खोज दर प्राप्त गर्न प्रोटीनहरू फिल्टर गरियो। Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициент ложного обяна %. दूषित हिटहरू हटाइयो र प्रोटिनहरूलाई <1% को गलत पत्ता लगाउनको लागि फिल्टर गरियो।去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率। <1% 的错误发现率। Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений %1 दूषित हिटहरू हटाइयो र <1% को गलत सकारात्मक दर प्राप्त गर्न प्रोटीन फिल्टर गरियो।लेबलको प्रयोग बिना मात्रात्मक विश्लेषणको लागि, तीन जैविक दोहोरिनेबाट सामान्यीकृत प्रोटीन सामग्री प्रयोग गरिएको थियो।प्रोटीन सबसेलुलर स्थानीयकरण विश्लेषण DAVID बायोइन्फर्मेटिक्स रिसोर्सेस, MitoCarta 3.0 र एलिस टिंग समूह द्वारा संकलित र प्रकाशित डाटाबेसहरूबाट Gene Ontology (GO) विश्लेषण प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।ज्वालामुखी नक्शा Perseus (v1.6.15.0) बाट प्राप्त गरिएको थियो। प्रोटीन प्रचुरता तह परिवर्तनहरू दुई-पक्षीय टी-परीक्षण प्रयोग गरेर सांख्यिकीय महत्त्वको लागि परीक्षण गरिएको थियो, र प्रोटीन हिटहरू प्रचुरता परिवर्तन> 2 (अन्यथा भने नभएसम्म) र p मान <0.05 सँग पहिचान गरियो। प्रोटीन प्रचुरता तह परिवर्तनहरू दुई-पक्षीय टी-परीक्षण प्रयोग गरेर सांख्यिकीय महत्त्वको लागि परीक्षण गरिएको थियो, र प्रोटीन हिटहरू प्रचुरता परिवर्तन> 2 (अन्यथा भने नभएसम्म) र p मान <0.05 सँग पहिचान गरियो। Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. प्रोटिन सामग्री तह परिवर्तनहरू सांख्यिकीय महत्त्वको लागि दुई-टेल्ड t-परीक्षण प्रयोग गरेर परीक्षण गरिएको थियो, र प्रोटिन मिलानहरू सामग्री परिवर्तन > 2 (अन्यथा नोट नगरेसम्म) र एपी मान <0.05 सँग पहिचान गरियो।使用 双边 t 检验 测试 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 显着性统计 显着性 显着性 显着性 显着性 中 的 的 的 的 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 (除非 另 有 有 说明) 和 p <0.05।使用 双边 t 检验 测试 测试 蛋白质 蛋白质 倍 变化 变化 的 统计 并 确定 确定 确定 丰度 ​​变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 (另 有 说明) 和 p <0.05। Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. प्रोटिन सामग्रीमा फोल्ड परिवर्तनहरूको सांख्यिकीय महत्त्व दुई-पुच्छ टी-परीक्षण प्रयोग गरेर परीक्षण गरिएको थियो, र सामग्री परिवर्तनहरू >2 (अन्यथा संकेत नगरेसम्म) र p-मानहरू <0.05 को लागि प्रोटीन मिलानहरू निर्धारण गरिएको थियो।स्ट्रिङ डाटाबेसको साथमा GO विश्लेषण प्रयोग गरेर प्रोटीन अन्तरक्रिया विश्लेषण गरिएको थियो।
तीनवटा जैविक प्रतिकृतिहरू समान नतिजाहरूको साथ गरिएको थियो।सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफप्याड प्रिज्म (ग्राफप्याड सफ्टवेयर) को साथ गरिएको थियो र ज्वालामुखी प्लटहरू पर्सियस (v1.6.15.0) को साथ उत्पन्न गरिएको थियो।दुई समूहहरू तुलना गर्न, p-मानहरू दुई-पुच्छर विद्यार्थीको t-परीक्षण प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।प्रायोगिक समूहमा कम्तिमा दुई पटक पहिचान गरिएका सिंगलटन प्रोटीनहरू मात्र ज्वालामुखी प्लटहरूमा समावेश गरिएको थियो, र नियन्त्रण समूहमा सम्बन्धित हराएको मानहरूलाई सामान्य वितरणबाट पर्सियससँग प्रतिस्थापन गरिएको थियो ताकि p-मान गणना गर्न सकिन्छ।त्रुटि बारहरूले औसत ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।सांख्यिकीय विश्लेषणको लागि प्रोटोमिक विश्लेषणहरूमा, कम्तिमा दुई जैविक प्रतिकृतिहरूमा देखा पर्ने प्रोटीनहरूको प्रशस्तता कायम राखिएको थियो।नमूना आकार पूर्व-निर्धारित गर्न सांख्यिकीय विधिहरू प्रयोग गरिएन।प्रयोगहरू अनियमित छैनन्।अनुसन्धानकर्ताहरू प्रयोग र परिणामहरूको मूल्याङ्कनको क्रममा कार्यहरूमा अन्धा थिएनन्।
अध्ययन डिजाइनको बारेमा थप जानकारीको लागि, यस लेखमा लिङ्क गरिएको प्रकृति अनुसन्धान रिपोर्ट सार हेर्नुहोस्।
यस अध्ययनमा प्राप्त मास स्पेक्ट्रोमेट्री डाटा डाटासेट ID PXD034811 (PDPL-MS डाटासेट) अन्तर्गत iProX57 पार्टनर रिपोजिटरी मार्फत ProteomeXchange Consortium मा पेश गरिएको थियो।कच्चा डाटा कच्चा डाटा फाइल को रूप मा प्रदान गरिन्छ।यो लेख मूल डाटा प्रदान गर्दछ।
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. छिमेकलाई चिन्न: प्रोटिन कम्प्लेक्स र नक्सा अर्गनेलहरू विशेषता गर्न निकटता-निर्भर बायोटिनाइलेशन प्रयोग गर्दै। Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. छिमेकलाई चिन्न: प्रोटिन कम्प्लेक्स र नक्सा अर्गनेलहरू विशेषता गर्न निकटता-निर्भर बायोटिनाइलेशन प्रयोग गर्दै।Gingras, AS, Abe, KT र Raut, B. परिवेशसँग परिचितता: प्रोटिन कम्प्लेक्स र नक्सा अर्गनेलहरू विशेषता गर्न निकटता-निर्भर बायोटिनाइलेशन प्रयोग गर्दै। Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. छिमेकलाई बुझ्दै: जैविक जीवनमा छिमेकको निर्भरता प्रयोग गर्नुहोस्।Gingras, AS, Abe, KT र Raut, B. समीपता बुझ्दै: प्रोटिन कम्प्लेक्सको विशेषता र निकटता-निर्भर बायोटिनाइलेशन प्रयोग गरेर अर्गानेल्सको म्यापिङ।वर्तमान।मेरो विचार।रासायनिक।जीवविज्ञान ४८, ४४–५४ (२०१९)।
गेरी, जेबी एट अल।प्रतिरक्षा कोशिकाहरूमा डेक्सटर ऊर्जा स्थानान्तरण गरेर सूक्ष्म वातावरण म्यापिङ।विज्ञान ३६७, १०९१–१०९७ (२०२०)।
Hertling, EL et al।दुई-प्रोटोम स्केल नेटवर्कहरूले मानव अन्तरक्रियाको सेल-विशिष्ट रिमोडेलिंग पत्ता लगाउँछन्।कक्षहरू 184, 3022–3040.e3028 (2021)।