समाचार

Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
क्यान्सर कोशिकाहरूले सेलुलर तनाव हटाउन र प्रगति गर्न जारी राख्न विभिन्न संयन्त्रहरू विकसित गरेका छन्।प्रोटीन किनेज आर (PKR) र यसको प्रोटीन एक्टिभेटर (PACT) प्रारम्भिक प्रतिक्रियाकर्ताहरू हुन् जसले विभिन्न तनाव संकेतहरू निगरानी गर्दछ जसले सेल प्रसार र एपोप्टोसिसको अवरोधलाई निम्त्याउँछ।यद्यपि, क्यान्सर कोशिकाहरूमा PACT-PKR मार्गको नियमन धेरै हदसम्म अज्ञात छ।यहाँ, हामीले लामो गैर-कोडिङ RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) प्रत्यक्ष रूपमा PACT-PKR मार्गको अवरोधमा संलग्न छ र क्यान्सर कोशिकाको विस्तारलाई बढावा दिन्छ भनेर फेला पार्यौं।CRISPRi 971 क्यान्सर-सम्बन्धित lncRNA को ठूलो मात्रामा कार्यात्मक स्क्रीनिंग प्रयोग गरेर, हामीले पत्ता लगायौं कि DARS-AS1 उल्लेखनीय रूपमा बढेको क्यान्सर सेल प्रसारसँग सम्बन्धित थियो।तसर्थ, DARS-AS1 नकआउटले सेल प्रसारलाई रोक्छ र भिट्रोमा विभिन्न क्यान्सर सेल लाइनहरूमा क्यान्सर सेल एपोप्टोसिसलाई बढावा दिन्छ र भिभोमा ट्युमरको वृद्धिलाई उल्लेखनीय रूपमा घटाउँछ।मेकानिकली रूपमा, DARS-AS1 ले PACT सक्रियता डोमेनमा सिधै बाँध्छ र PACT-PKR अन्तरक्रियालाई रोक्छ, जसले गर्दा PKR सक्रियता, eIF2α फास्फोरिलेसन, र एपोप्टोटिक सेल मृत्युलाई रोक्छ।चिकित्सकीय रूपमा, DARS-AS1 धेरै क्यान्सरहरूमा व्यापक रूपमा व्यक्त गरिएको छ, र यो lncRNA को ओभरएक्सप्रेसन खराब रोगको संकेत हो।यस अध्ययनले DARS-AS1 lncRNA द्वारा PACT-PKR मार्गको क्यान्सर-विशिष्ट नियमनलाई स्पष्ट पार्छ र क्यान्सर रोगको निदान र उपचारको लागि अर्को लक्ष्य प्रदान गर्दछ।
तनावमा अनुकूलन गर्ने क्षमता क्यान्सर कोशिकाको अस्तित्व र प्रसारको महत्त्वपूर्ण विशेषता हो।कठोर सूक्ष्म वातावरणमा क्यान्सर शिखरको द्रुत प्रसार र मेटाबोलिक हलमार्कहरू - पोषक तत्वको अभाव, हाइपोक्सिया, र कम pH - जसले सेल मृत्यु संकेत गर्ने मार्गहरू ट्रिगर गर्न सक्छ।तनाव-संवेदनशील जीनहरू जस्तै p535, तातो झटका प्रोटीन 6, 7, KRAS8, 9, र HIF-110, 11, 12, 13 को विनियमन प्रायः क्यान्सरमा अवलोकन गरिन्छ, जसले गर्दा एपोप्टोसिसलाई रोक्छ र बाँच्नको लागि बढावा दिन्छ।
प्रोटीन किनेज R (PKR) युकेरियोटिक इनिशिएशन फ्याक्टर 2α (eIF2α) को एक महत्त्वपूर्ण तनाव सेन्सर र सब्युनिट किनेज हो, एक अनुवादात्मक नियामक जसले सेलुलर तनावलाई सेल मृत्युसँग जोड्छ।PKR लाई मूल रूपमा विदेशी डबल-स्ट्र्यान्डेड RNA (dsRNA) को पत्ता लगाएर एन्टिभाइरल प्रोटीनको रूपमा पहिचान गरिएको थियो।सक्रियतामा, PKR phosphorylates eIF2α भाइरल र सेलुलर प्रोटीन संश्लेषण 14,15,16 लाई रोक्न।PACT (PKR एक्टिभेटर प्रोटीन) लाई dsRNA17,18,19,20,21,22,23 को अनुपस्थितिमा पहिलो PKR एक्टिभेटर प्रोटिनको रूपमा पहिचान गरिएको छ।PKR सँग प्रत्यक्ष अन्तरक्रिया मार्फत, PACT ले PKR र डाउनस्ट्रीम सिग्नलिङ मार्गहरूमा विभिन्न तनावहरू (सीरम भोकमरी, पेरोक्साइड वा आर्सेनाइट उपचार) लाई ट्रान्सड्युस गर्छ।eIF2α phosphorylation को अतिरिक्त, PACT-मध्यस्थता PKR सक्रियताले तनाव प्रतिक्रियासँग सम्बन्धित विभिन्न घटनाहरू ट्रिगर गर्दछ, PI3K/Akt24 मार्ग मार्फत परिवर्तन गरिएको redox स्थिति सहित, p5325,26 मार्फत DNA क्षति जाँच र NF-κB27,28 ट्रान्सक्रिप्शन, 29 लाई नियमन गर्दछ। तनाव प्रतिक्रिया, प्रसार, एपोप्टोसिस र अन्य प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाहरूमा तिनीहरूको महत्वपूर्ण भूमिकालाई ध्यानमा राख्दै, PKR र PACT ले धेरै रोगहरू, विशेष गरी क्यान्सर 30,31,32,33 को लागि उपचारात्मक लक्ष्यहरू प्रतिज्ञा गर्दै छन्।यद्यपि, यो प्लियोट्रोपिक कार्यात्मक र जैविक महत्वको बावजुद, क्यान्सर कोशिकाहरूमा PACT/PKR गतिविधिको नियमन मायावी रहन्छ।
lncRNA 200 न्यूक्लियोटाइडहरू भन्दा ठूलो ट्रान्सक्रिप्टहरू हुन् जसमा कुनै प्रोटीन-कोडिङ क्षमता छैन।अत्याधुनिक सम्पूर्ण जीनोम अनुक्रमण परियोजनाहरूले हजारौं lncRNAs पहिचान गरिसकेपछि, 35,36 तिनीहरूको जैविक कार्यहरू स्पष्ट गर्न धेरै प्रयास गरिएको छ।अनुसन्धानको बढ्दो निकायले देखाएको छ कि lncRNAs धेरै जैविक प्रक्रियाहरूमा संलग्न छन् 37 सहित X-क्रोमोजोम निष्क्रियताको नियमन 38,39, इम्प्रिन्टिङ40, ट्रान्सक्रिप्शन41,42, अनुवाद43 र क्यान्सरको वृद्धि44,45,46,47।यी अध्ययनहरूले रिपोर्ट गरे कि धेरै lncRNAs PACT/PKR मार्गमा संलग्न छन्।यस्तो एउटा अध्ययनले देखाएको छ कि lncRNA ASPACT ले PACT ट्रान्सक्रिप्शनलाई रोकेको छ र PACT mRNA को परमाणु अवधारण बढाएको छ।अन्य अध्ययनहरूले देखाएको छ कि lncRNA nc886 PKR सँग जोडिएको छ र यसको फोस्फोरिलेसन 49,50 लाई रोक्छ।अहिलेसम्म, lncRNA विनियमित PACT- मध्यस्थता PKR सक्रियता रिपोर्ट गरिएको छैन।
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) लाई oncogenic lncRNA51,52,53,54 को रूपमा पहिचान गरिएको छ।miP-194-5p53, miP-12952 र miP-532-3p51 को नियमन मार्फत, DARS-AS1 लाई क्रमशः स्पष्ट सेल रेनल सेल कार्सिनोमा, थाइरोइड कार्सिनोमा र गैर-सानो सेल फोक्सोको कार्सिनोमाको वृद्धिलाई बढावा दिन देखाइएको छ।टोङ र सहकर्मीहरूले यो पनि फेला पारे कि DARS-AS1 ले प्रोटीन 39 (RBM39) RNA-बाइन्डिङ मोटिफको स्थिरता कायम गरेर माइलोमा प्रगतिलाई बढावा दिन्छ।यद्यपि, यो lncRNA PACT-PKR सक्रियता र क्यान्सर कोशिकाहरूको तनाव प्रतिक्रियाको नियमनमा संलग्न छ कि छैन भन्ने बारेमा कुनै अध्ययन गरिएको छैन।
यहाँ, हामीले CRISPRi प्रणाली प्रयोग गरेर ठूलो मात्रामा हानि-अफ-फंक्शन स्क्रिन प्रदर्शन गर्यौं र DARS-AS1 lncRNA ले धेरै प्रकारका क्यान्सर कोशिकाहरूको विस्तारलाई बढावा दिन्छ भनेर निर्धारण गर्‍यौं।थप रूपमा, हामीले एउटा प्रमुख संयन्त्र पहिचान गरेका छौं: DARS-AS1 ले प्रत्यक्ष रूपमा PACT मा बाँध्छ, PACT र PKR बाइन्डिङलाई रोक्छ, eIF2α को फोस्फोरिलेसन रोक्छ, कम PKR सब्सट्रेट, र अन्ततः एपोप्टोटिक सेल मृत्युलाई रोक्छ।अन्तमा, हाम्रो कामले DARS-AS1 lncRNA लाई PACT-PKR मार्गको नियामक र क्यान्सर उपचार र रोगको निदानको लागि सम्भावित लक्ष्यको रूपमा प्रकट गर्दछ।
व्यापक जीनोमिक प्रोफाइलिङ अध्ययनहरूले क्यान्सरसँग सम्बन्धित सयौं lncRNAs पहिचान गरेका छन्।यद्यपि, तिनीहरूको प्रकार्य धेरै हदसम्म अज्ञात रहन्छ56।क्यान्सरको प्रगतिमा संलग्न आशाजनक lncRNA उम्मेद्वारहरू पहिचान गर्न, हामीले CRISPRi प्रणाली (चित्र 1a) को प्रयोग गरेर SW620 कोलोरेक्टल क्यान्सर सेल लाइनमा कम फैलावटको लागि हानि-अफ-फंक्शन स्क्रिन प्रदर्शन गर्‍यौं।SW480 र SW620 कोलोन क्यान्सर सेल लाइनहरूको अद्वितीय विशेषता यो हो कि तिनीहरू एकल बिरामीमा प्राथमिक र माध्यमिक ट्युमरहरूबाट व्युत्पन्न हुन्छन्।यसले उन्नत कोलोन क्यान्सरको प्रगतिमा आनुवंशिक परिवर्तनहरू अध्ययन गर्नको लागि मूल्यवान तुलना प्रदान गर्दछ।त्यसकारण, हामीले आरएनए अनुक्रमण प्रयोग गरेर कोलोरेक्टल क्यान्सर सेल लाइनहरू (SW480 र SW620) को ट्रान्सक्रिप्टोमहरू विश्लेषण गर्यौं र प्रकाशित साहित्यबाट केही सम्भावित कार्यात्मक lncRNA हरू संकलन गर्‍यौं।यी नतिजाहरूको आधारमा, हामीले 7355 sgRNA oligos समावेश गरी 971 क्यान्सर-सम्बन्धित lncRNAs र नकारात्मक नियन्त्रणका लागि 500 ​​अनलक्षित sgRNA oligos (पूरक डेटा 1) को लागि एक पूल गरिएको sgRNA पुस्तकालय डिजाइन गर्यौं।
CRISPRi प्रणाली प्रयोग गरेर स्क्रीनिंग को योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।ख स्क्रीनिंग पछि sgRNA संवर्धन।तेर्सो डटेड रेखाले log2 (फोल्ड परिवर्तन) = ±0.58 लाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।ठाडो बिन्दु भएको रेखाले p मान = ०.०५ लाई संकेत गर्छ।कालो थोप्लाहरूले गैर-लक्ष्य sgRNA (NC को रूपमा नामित) प्रतिनिधित्व गर्दछ।रातो थोप्लाहरू DARS-AS1 लाई लक्षित गर्ने sgRNA हरू हुन्।निलो थोप्लाहरू LINC00205 लाई लक्षित गर्ने sgRNA हुन्, पहिले वर्णन गरिएको oncogenic lncRNA।तह परिवर्तन = (सामान्य पठन, दिन 17)/(सामान्य पठन, दिन 0)।c DARS-AS1 sgRNA नकडाउनले कोशिकाको वृद्धिलाई रोक्यो।त्रुटि बारहरू तीन प्रयोगहरूको ± मानक विचलन प्रतिनिधित्व गर्दछ।* p ≤ ०.०५, ** p ≤ ०.०१ दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी-परीक्षा।ट्युमरमा DARS-AS1 अभिव्यक्ति (TCGA डाटासेट)।क्रमशः BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, र COAD भएका बिरामीहरूबाट जोडी सामान्य र ट्युमर नमूनाहरूमा DARS-AS1 को अभिव्यक्ति (TCGA डेटासेट)।पी-मानहरू जोडा बनाइएको दुई-पुच्छे विद्यार्थीको टी-टेस्ट प्रयोग गरेर प्राप्त गरियो।
प्लाज्मिड निर्माण र लेन्टिभाइरस प्याकेजिङ पछि, हामीले चार स्वतन्त्र संक्रमण प्रयोगहरूमा माथिको पुस्तकालयको साथ dCas9-SW620 कोलोरेक्टल क्यान्सर सेल लाइनलाई ट्रान्सड्युस गर्यौं।यी संक्रमणहरूको लागि संक्रमणको बहुलता (MOI) 0.1-0.3 थियो, प्रत्येक कोशिकालाई केवल एक sgRNA बाट ट्रान्सफेक्ट गर्न सकिन्छ भनेर संकेत गर्दछ।इन भिट्रो कल्चरको 18 दिन पछि, लक्षित sgRNAs को संवर्धन प्रोफाइल स्क्रीनिंग पछि घट्यो वा बढ्यो, जबकि गैर-लक्षित नियन्त्रण ओलिगोन्यूक्लियोटाइडहरूको संख्या पूर्व-स्क्रिनिंग प्रोफाइलको तुलनामा अपेक्षाकृत अपरिवर्तित रह्यो, यसले संकेत गर्दछ कि हाम्रो लक्ष्यमा उच्च स्क्रिन-विशिष्ट छ। पुस्तकालय।चामल।1b र पूरक तालिका 1)। LINC00205, जुन पहिले फोक्सोको क्यान्सर र कलेजोको क्यान्सरको प्रगति ५८,५९,६० लाई बढावा दिन रिपोर्ट गरिएको थियो, यो स्क्रीनिङको विश्वसनीयता पुष्टि गर्दै (लग२ (फोल्डचेन्ज) < −०.५८, p मान <०.०५) जाँच गरिएको थियो (चित्र १b)। LINC00205, जुन पहिले फोक्सोको क्यान्सर र कलेजोको क्यान्सरको प्रगति ५८,५९,६० लाई बढावा दिन रिपोर्ट गरिएको थियो, यो स्क्रीनिङको विश्वसनीयता पुष्टि गर्दै (लग२ (फोल्डचेन्ज) < −०.५८, p मान <०.०५) जाँच गरिएको थियो (चित्र १b)। LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис १ ख)। LINC00205, पहिले फोक्सोको क्यान्सर र कलेजोको क्यान्सरको प्रगतिलाई बढावा दिन रिपोर्ट गरिएको थियो 58,59,60, बहिष्कृत गरिएको थियो (log2 (fold change) <-0.58, p-value <0.05), यस स्क्रीनिंगको बलियोता पुष्टि गर्दै (Fig. 1b) । लिंक 0005 之前 之前 之前 报道 报道 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 进展 肝癌 选 选 选 选选 掉 (लग 2 (倍数 倍数) <-0.58, p 值 该 的 的 的 可靠性 可靠性的। लिंक 0005 之前 之前 之前 报道 报道 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 进展 肝癌 选 选 选 选选 掉 (लग 2 (倍数 倍数) <-0.58, p 值 该 的 的 的 可靠性 可靠性的। LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис १ ख)। LINC00205, पहिले फोक्सो र कलेजोको क्यान्सरको प्रगतिलाई बढावा दिन रिपोर्ट गरिएको थियो 58,59,60, बहिष्कार गरिएको थियो (log2 (fold change) <-0.58, p-value <0.05), यस स्क्रीनिंगको बलियोता पुष्टि गर्दै (Fig. .1b)।
परीक्षण गरिएका सबै lncRNA हरू मध्ये, DARS-AS1 लाई पनि जाँच गरिएको थियो, जसमा तीन कोग्नेट sgRNA oligonucleotides 18 दिनको संस्कृति पछि उल्लेखनीय रूपमा कम भएको थियो, जसले सुझाव दिन्छ कि यो lncRNA को नकडाउनले क्यान्सरको फैलावट घटाएको छ (चित्र 1b)।यो नतिजा कोलोरेक्टल क्यान्सर कोशिकाहरूमा MTS विश्लेषणद्वारा थप समर्थन गरिएको थियो कि DARS-AS1 नकडाउन कोशिकाहरूको वृद्धि दर नियन्त्रण कक्षहरू (चित्र 1c) को तुलनामा आधा मात्र थियो र धेरै अन्य क्यान्सर प्रकारहरूको अघिल्लो रिपोर्टहरूसँग अनुरूप थियो।: स्पष्ट सेल मृगौला क्यान्सर, थाइरोइड क्यान्सर र गैर-सानो कोशिका फोक्सोको क्यान्सर ५१,५२,५३,५५।यद्यपि, कोलोरेक्टल क्यान्सरमा यसको कार्य र आणविक संयन्त्रहरू अस्पष्ट छन्।त्यसैले, हामीले थप अध्ययनको लागि यो lncRNA रोज्यौं।
बिरामीहरूमा DARS-AS1 अभिव्यक्ति अध्ययन गर्न, हामीले क्यान्सर जेनोम एटलस (TCGA) परियोजनाबाट 10,327 ट्युमर नमूनाहरू व्यापक रूपमा विश्लेषण गर्यौं।हाम्रा नतिजाहरूले देखाउँछन् कि DARS-AS1 कोलोन एडेनोकार्सिनोमा (COAD), रेनल क्लियर सेल कार्सिनोमा (KIRC), र रेनल प्यापिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP) सहित विभिन्न प्रकारका ट्यूमरहरूमा स्वस्थ कोशिकाहरूमा व्यापक रूपमा अभिव्यक्त र महत्त्वपूर्ण रूपमा अपरेगुलेट गरिएको छ।।धेरै थोरै (चित्र 1d र पूरक चित्र 1a, b)। जोडी स्वस्थ/ट्यूमर नमूनाहरूको विश्लेषणले थप मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा (BLCA), मृगौला मृगौला स्पष्ट सेल कार्सिनोमा (KIRC), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (PRAD), फोक्सो स्क्वामस सेल कार्सिनोमा (LUSC) को ट्युमरहरूमा DARS-AS1 को उच्च अभिव्यक्ति पुष्टि गर्‍यो। , गर्भाशय कोर्पस एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (UCEC), फोक्सो एडेनोकार्सिनोमा (LUAD), कलेजो हेपाटोसेलुलर कार्सिनोमा (LIHC), मृगौला रेनल पेपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), र कोलोन एडेनोकार्सिनोमा (COAD) (p मान <0.05) (चित्र 1e) । जोडी स्वस्थ/ट्यूमर नमूनाहरूको विश्लेषणले थप मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा (BLCA), मृगौला मृगौला स्पष्ट सेल कार्सिनोमा (KIRC), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (PRAD), फोक्सो स्क्वामस सेल कार्सिनोमा (LUSC) को ट्युमरहरूमा DARS-AS1 को उच्च अभिव्यक्ति पुष्टि गर्‍यो। , गर्भाशय कोर्पस एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (UCEC), फोक्सो एडेनोकार्सिनोमा (LUAD), कलेजो हेपाटोसेलुलर कार्सिनोमा (LIHC), मृगौला रेनल पेपिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), र कोलोन एडेनोकार्सिनोमा (COAD) (p मान <0.05) (चित्र 1e) ।जोडी स्वस्थ/ट्यूमर नमूनाहरूको विश्लेषणले पनि मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा (BLCA), क्लियर सेल रेनल र रेनल सेल कार्सिनोमा (KIRC), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (PRAD), फोक्सो स्क्वामस सेल कार्सिनोमा (LUSC) ट्युमरहरूमा DARS-AS1 को उच्च अभिव्यक्ति पुष्टि गर्‍यो।, карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m)। , कोर्पस uteri (UCEC) को एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा, फोक्सो को एडेनोकार्सिनोमा (LUAD), कलेजो को hepatocellular कार्सिनोमा (LIHC), मृगौला को papillary सेल कार्सिनोमा (KIRP), र बृहदान्त्र को adenocarcinoma (COAD) (p मान < 0.05) (चित्र 1e-m)।配对 健康 / 肿瘤样本 的 的 进一步 了 了 了 了 了 了 在 在 上 上 上 上 尿路 上 上 上 皮癌 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 上 上细胞癌 (KIRC), 前列 腺腺癌 (प्रको), 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 的 的显着 更 高高 表达高, 子宫体子宫 内膜 癌 (ucad), 肺腺癌 (लुड), 肝肝 细胞癌 (lihc), 肾 肾 乳头状 乳头状 (poad) 和结肠腺癌 (paad) (p 值) <0.05）（图1e-m）।配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达 表达高 表达 表达 表达 表达内膜 (Luad) 肝肝 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 细胞乳头状癌 (kirp）) （coad） (p 值<0.05）） (图1e-m）)।स्वस्थ/ट्यूमर जोडी नमूनाहरूको विश्लेषणले मूत्राशय यूरोथेलियल कार्सिनोमा (BLCA), क्लियर सेल रेनल सेल कार्सिनोमा (KIRC), प्रोस्टेट एडेनोकार्सिनोमा (PRAD), र फोक्सो स्क्वामस सेल कार्सिनोमा (LUSC) ट्युमरहरूमा DARS-AS1 को भूमिकालाई समर्थन गर्‍यो।экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m)। कार्पस गर्भाशय कार्सिनोमा (UCEC), फोक्सो एडेनोकार्सिनोमा (LUAD), हेपाटोसेलुलर कार्सिनोमा (LIHC), रेनल प्यापिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), र कोलोन एडेनोकार्सिनोमा (COAD) (p मान <0.05) (चित्र 1e -m) मा अभिव्यक्ति।सँगै लिएर, यी परिणामहरूले संकेत गर्दछ कि DARS-AS1 विभिन्न प्रकारका क्यान्सरहरूमा व्यापक र उच्च रूपमा व्यक्त गरिएको छ।
किनकी DARS-AS1 र DARS (एन्टिसेन्स स्ट्र्यान्डलाई एन्कोड गर्ने जीन) एउटै प्रमोटर साझा गर्दछ र एकअर्काको छेउमा अवस्थित छन्, हामीले shRNA लाई विशेष रूपमा DARS-AS1 लाई नकडाउन गर्न डिजाइन गरेका छौं तर DARS होइन (पूरक चित्र 2a,b र पूरक तालिका 2) ।SW620 को अतिरिक्त, हामीले shRNA नकडाउन (पूरक तालिका 3) को प्रभावकारिता र प्रकार्य अध्ययन गर्न DARS-AS1 लाई उच्च रूपमा व्यक्त गर्ने तीन अन्य सेल लाइनहरू पनि प्रयोग गर्यौं।हाम्रा नतिजाहरूले संकेत गरे कि विकसित गरिएका सबै तीन shRNAs ले DARS mRNA (पूरक चित्र 2c–f) को मात्रामा थोरै प्रभाव पारेर कम्तिमा 80% DARS-AS1 नकडाउन दक्षता हासिल गरेको छ।थप रूपमा, हामीले पत्ता लगायौं कि यी shRNAs सँग DARS-AS1 नकडाउनले कोलोरेक्टल क्यान्सर सेल लाइनहरू SW620 (49.7%) र HCT116 (27.7%), स्तन क्यान्सर सेल लाइन MBA-MD-231 (53.4%) मा सेल वृद्धिलाई उल्लेखनीय रूपमा रोकेको छ।) र HepG2 हेपाटोमा सेल लाइन (92.7% कमी), साथसाथै तिनीहरूको अलंकृत क्षेत्रहरू बनाउन सक्ने क्षमता (~ 50.8%, 44.6%, 40.7% र 75.7% प्रति सेल लाइनको औसत कमी) (चित्र 2a,b)।SW620 मा, कोलोनी गठन परखको नतिजाले थप पुष्टि गर्‍यो कि DARS-AS1 shRNA ले लगभग 69.6% (चित्र 2c) को औसत कमीको साथ कोशिकाको प्रसारलाई उल्लेखनीय रूपमा रोकेको छ।
SW620, HCT116, MBA-MD-231, र HepG2 कोशिकाहरूमा सेल प्रसार (a) र spheroid गठन (b) मा नियन्त्रण shRNA र DARS-AS1 shRNA को प्रभाव।c नियन्त्रण shRNA र DARS-AS1 shRNA को प्रभाव SW620 कक्षहरूमा कोलोनी गठनमा।DARS-AS1 लाई ओभरएक्सप्रेस गर्ने SW620 कोशिकाहरूको कोशिका विस्तार (d), गोलाकार गठन (e), र उपनिवेश गठन (f)।देखाइएको डेटा तीन प्रयोगहरूको औसत ± मानक विचलन हो।* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, र *** p ≤ 0.001 दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी-परीक्षाद्वारा।
हानि-अफ-फंक्शन अध्ययनहरू पूरा गर्न, हामीले अर्को पटक DARS-AS1 (पूरक चित्र 2g) ओभरएक्सप्रेस गर्ने SW620 सेलहरू सिर्जना गर्यौं।DARS-AS1 ओभरएक्सप्रेसनले SW620 कोशिकाहरूमा कोशिकाको वृद्धि (1.8-गुणा), अनन्कोर्ड स्फेरोइड गठन (1.4-गुणा), र कोलोनी गठन (3.3-गुणा) मा उल्लेखनीय रूपमा वृद्धि गर्‍यो (चित्र 2d–f)।हामीले अर्को DARS-AS1 व्यक्त गर्ने सेल लाइन, A549 प्रयोग गरेर यो नतिजा पुष्टि गर्यौं।DARS-AS1 overexpression को कारणले यो परिष्कृत सेल प्रसार A549 कोशिकाहरूमा थप अवलोकन गरियो (पूरक चित्र 2h, i र पूरक तालिका 3)।सँगै लिइएको, यी लाभ र हानि अध्ययनहरूले देखाउँछ कि DARS-AS1 ले भिट्रोमा क्यान्सर सेल प्रसारलाई बढावा दिन्छ।
DARS-AS1 ले कोशिकाको प्रसारलाई नियन्त्रण गर्ने अन्तर्निहित संयन्त्रको अन्वेषण गर्न, हामीले यसको सम्भावित प्रोटीन-बाइन्डिङ साझेदारहरू पहिचान गर्न आरएनए पुल-डाउन विश्लेषण गरेका छौं।RT-qPCR परिणामहरूले देखाए कि DARS-AS1 को लगभग 86.2% SW620 कोशिकाहरूको साइटोप्लाज्ममा अवस्थित छ (पूरक चित्र 3a)।इन भिट्रो ट्रान्सक्राइब गरिएको बायोटिनाइलेटेड DARS-AS1 वा pseudoRNA त्यसपछि SW620 सेल lysates संग इन्क्युबेटेड थियो र SDS-PAGE पृथकीकरण पछि।त्यसपछिको चाँदीको दागले DARS-AS1 पुल नमूनाहरूमा फरक ब्यान्ड (~38 kDa) उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध भएको देखाएको छ तर डमी RNA वा मोती नमूनाहरूमा होइन (चित्र 3a)।यस ब्यान्डलाई मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारा PKR सक्रिय गर्ने प्रोटीन (PACT) को रूपमा पहिचान गरिएको थियो र SW620, HCT116, र HepG2 सेल लाइनहरू (चित्र 3a,b) मा इम्युनोब्लोटिंग द्वारा थप पुष्टि गरिएको थियो।DARS र सम्बन्धित PACT प्रोटीनहरू - PKR र TRBP - को संवर्धन पनि पश्चिमी ब्लोटिंग (WB) द्वारा आरएनए विश्लेषण प्रयोग गरेर अनुसन्धान गरिएको थियो।नतिजाहरूले संकेत गरे कि DARS-AS1 RNA र यी तीन प्रोटीनहरू बीच कुनै सीधा अन्तरक्रिया भेटिएन (पूरक चित्र 3b)।DARS-AS1 र PACT बीचको विशिष्ट अन्तरक्रियालाई RNA इम्युनोप्रेसिपिटेसन (RIP) विश्लेषणद्वारा थप पुष्टि गरिएको थियो, जसले देखायो कि DARS-AS1 एन्टि-PACT एन्टिबडीहरूमा उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध थियो तर अन्य नियन्त्रण RNAs (चित्र 3c) होइन।DARS-AS1 ले PACT सँग सीधै अन्य कुनै सेलुलर कम्पोनेन्टहरूको अनुपस्थितिमा अन्तरक्रिया गर्छ कि भनेर निर्धारण गर्न, इन भिट्रो बायोलेयर इन्टरफेरोमेट्री (BLI) परख शुद्ध PACT प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।बायोटिन-लेबल गरिएको DARS-AS1 वा डमी RNA लाई स्ट्रेप्टाभिडिन (SA) बायोसेन्सरहरूमा स्थिर गरिएको थियो र त्यसपछि 1 μM PACT भएको काइनेटिक बफरमा इन्क्युबेटेड थियो।विशेष रूपमा, PACT DARS-AS1 (KD मान ~ 26.9 nM) मा कडा रूपमा बाँधिएको छ, तर RNA (चित्र 3d) को नक्कल गर्न होइन।सँगै लिएर, यी परिणामहरूले DARS-AS1 र PACT बीच प्रत्यक्ष अन्तरक्रिया र उच्च आत्मीयता देखाउँछन्।
RNA पुल विश्लेषणले SW620 कक्षहरूमा PACT सँग अन्तरक्रिया गर्ने DARS-AS1 पहिचान गर्यो।माथि, सम्बन्धित प्रोटीनको चाँदीको दाग।तल्लो इम्युनोब्लोट्स एन्टि-PACT एन्टिबडीको साथ प्रदर्शन गरिएको थियो।b RNA पुल-डाउन विश्लेषण HCT116 (शीर्ष) र HepG2 (तल) कक्षहरूमा प्रदर्शन गरिएको थियो।PACT संवर्धन इम्युनोब्लोटिंग द्वारा पत्ता लगाइएको थियो।संकेतित एन्टिबडीहरू प्रयोग गरेर SW620 कोशिकाहरूमा cRNA इम्युनोप्रेसिपिटेशन (RIP) assays प्रदर्शन गरिएको थियो।d पूर्ण-लम्बाइ DARS-AS1 वा नियन्त्रण RNA मा PACT बाध्यकारी कर्भहरू बायोलेयर इन्टरफेरोमेट्री (BLI) को प्रयोग गरेर प्राप्त गरियो।आरएनए स्ट्रेप्टाभिडिन बायोसेन्सरमा स्थिर गरिएको थियो।1 μM PACT एसोसिएशन मापन गर्न प्रयोग गरिएको थियो।e RNA पुल परख बायोटिनिलेटेड पूर्ण-लम्बाइ DARS-AS1 वा काटिएको (शीर्ष) प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।इम्युनोब्लट PACT प्राप्त देखाउँदै (तल)।f प्युरिफाइड फ्ल्याग गरिएको PACT लाई बायोटिनाइलेटेड पूर्ण-लम्बाइ DARS-AS1 वा इन भिट्रो RIP परखको लागि काटिएको (e मा जस्तै) द्वारा इन्क्युटेड गरिएको थियो।निकालिएको आरएनए RT-qPCR द्वारा प्रमाणित गरिएको थियो।g PACT को लागि विभिन्न RNA टुक्राहरूको सापेक्ष सम्बन्ध बायोलेयर इन्टरफेरोमेट्री प्रयोग गरेर प्राप्त गरिएको थियो।विश्लेषणको लागि, 100 nM RNA र 1 μM RAST प्रयोग गरियो।h इन भिट्रो RIP assays शुद्ध अक्षुण्ण वा काटिएको लेबल PACT प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरियो।निकालिएको आरएनए RT-qPCR द्वारा प्रमाणित गरिएको थियो।i DARS-AS1, PACT, वा दुबै ओभरएक्सप्रेस गर्ने SW620 कोशिकाहरूको वृद्धि दर।j SW620 कक्षहरूमा पूर्ण-लम्बाइ वा काटिएको DARS-AS1 को ओभरएक्सप्रेसनले कोशिकाको वृद्धिमा फरक प्रभाव पारेको थियो।k एपोप्टोसिस एन्टि-PARP एन्टिबडीको साथ इम्युनोब्लोटिंग द्वारा पत्ता लगाइएको थियो।l DARS-AS1 को नकआउटले SW620 कोशिकाहरूको एपोप्टोसिसलाई फ्लो साइटोमेट्रीले देखाएको छ।देखाइएको डेटा तीन प्रयोगहरूको औसत ± मानक विचलन हो। *p ≤ ०.०५, **p ≤ ०.०१, ***p ≤ ०.००१, ****p <०.००१, दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी परीक्षणद्वारा। *p ≤ ०.०५, **p ≤ ०.०१, ***p ≤ ०.००१, ****p <०.००१, दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी परीक्षणद्वारा। *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента। *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी-परीक्षाद्वारा। *p ≤ ०.०५, **p ≤ ०.०१, ***p ≤ ०.००१, ****p <०.००१, 通过双尾学生t 检验। *p ≤ ०.०५, **p ≤ ०.०१, ***p ≤ ०.००१, ****p <०.००१, 通过双尾学生t 检验। *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента। *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी-परीक्षाद्वारा।
हामीले त्यसपछि PACT एसोसिएशन (चित्र 3e) को लागि आवश्यक DARS-AS1 क्षेत्र पहिचान गर्न इन भिट्रो ट्रान्सक्रिप्शन द्वारा तीन बायोटिनिलेटेड DARS-AS1 RNA टुक्राहरू उत्पन्न गर्यौं।RNA विश्लेषण परिणामहरूले प्रत्येक टुक्राले PACT सँग अन्तर्क्रिया गर्न सक्षम भएको देखाएको छ, तर 3′-टर्मिनल क्षेत्र (384–768 न्यूक्लियोटाइडहरू A3 लेबल गरिएको) ले 1–384 न्यूक्लियोटाइडहरू A1 लेबल गरिएको भन्दा बढी देखायो (चित्र 3e)।पुन: संयोजक PACT (चित्र 3f) प्रयोग गरेर इन भिट्रो RIP परखमा समान परिणामहरू अवलोकन गरियो।यी नतिजाहरूसँग अनुरूप, BLI प्रयोग गरेर PACT मा स्थिर RNA टुक्राहरू बाँध्न प्रयोगहरूले पनि PACT सँग A3 (384–768 nt) (लगभग 94.6 nM को KD मान) को लागि उच्च आत्मीयता रहेको देखाएको छ, जबकि अन्य क्षेत्रहरूसँग लगभग कुनै लिङ्क छैन।(चित्र 3d)।
हामीले PACT मा सम्बन्धित बाध्यकारी क्षेत्रहरू पनि जाँच्यौं।PACT ले तीन कार्यात्मक डोमेनहरू समावेश गर्दछ, जसमध्ये दुईवटा डबल-स्ट्र्यान्डेड RNA-बाइन्डिङ डोमेनहरू (dsRBD) र तेस्रो डोमेन (निर्दिष्ट D3) संरक्षित छन् जसले प्रोटीन अन्तरक्रियाको सक्रियकर्ताको रूपमा कार्य गर्दछ।प्रत्येक डोमेनको lncRNA बाध्यकारी क्षमताको जाँच गर्न, हामीले तीनवटा म्युटेसनहरू इन्जिनियर गर्यौं जसले प्रत्येक तीन डोमेनहरू हटायो र इन भिट्रो RIP परख प्रदर्शन गर्‍यो।हाम्रा नतिजाहरूले देखाए कि PACT को तेस्रो डोमेन (D3) को मेटाउनुले अन्य दुई उत्परिवर्तन (चित्र 3h) को तुलनामा DARS-AS1 (अक्षुण्ण PACT को तुलनामा 0.11-गुणाले) सँगको अन्तरक्रियालाई उल्लेखनीय रूपमा घटाएको छ, यो देखाइएको थियो कि रिलीज। D3 को DARS सँग अन्तरक्रिया भयो।-AC1।सँगै लिइएको, यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि DARS-AS1 र PACT बीचको अन्तरक्रिया मुख्य रूपमा DARS-AS1 को 3′ अन्त्य र PACT को D3 डोमेन मार्फत हुन सक्छ।
हामीले नोट गर्‍यौं कि DARS-AS1 ले PACT अभिव्यक्तिमा कुनै प्रभाव पारेन र PACT ले DARS-AS1 (पूरक चित्र 3c) मा कुनै प्रभाव पारेन।हामीले त्यसपछि सेल वृद्धिमा PACT नकडाउनको प्रभावको जाँच गर्यौं।DARS-AS1 को विपरित, PACT लाई ढकढक गर्दा सापेक्ष कक्षहरू 1.5-3 गुणा छिटो बढ्यो (पूरक चित्र। 3d)।कोलोनी गठन परखको नतिजाले संकेत गर्यो कि PACT (पूरक चित्र 3e) को साथ shRNA उपचार पछि कोशिकाहरूले 2-3-गुणा उपनिवेशहरू गठन गरे।DARS-AS1 ले PACT मार्फत कोशिका विस्तारलाई नियन्त्रण गर्छ कि गर्दैन भनेर परीक्षण गर्न, हामीले PACT, DARS-AS1, वा दुवैलाई ओभरएक्सप्रेस गर्ने SW620 कक्षहरू उत्पन्न गर्यौं।PACT को ओभरएक्सप्रेसनले सेल प्रसारको महत्त्वपूर्ण अवरोध देखायो (चित्र 3i)।जबकि DARS-AS1 ओभरएक्सप्रेसन प्रति se कोशिका प्रसारलाई महत्त्वपूर्ण रूपमा बढावा दियो, त्यहाँ DARS-AS1 र PACT लाई ओभरएक्सप्रेस गर्ने कोशिकाहरूको वृद्धि दरमा कुनै महत्त्वपूर्ण भिन्नता थिएन।यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि PACT ले DARS-AS1 ओभरएक्सप्रेसनको कारणले बढेको प्रसारलाई प्रतिरोध गर्न सक्छ।
DARS-AS1 का विभिन्न क्षेत्रहरूमा विभिन्न PACT-बाध्यकारी क्षमताहरू भएकाले, हामीले DARS-AS1 टुक्राहरूको विभिन्न ओभरएक्सप्रेसनद्वारा सेल प्रसारमा तिनीहरूको सापेक्ष प्रभावको अनुसन्धान गर्यौं।अन्य दुई टुक्राहरूको तुलनामा, DARS-AS1 3′ अन्त (384–768 nt), DARS-AS1 मा मुख्य PACT-सम्बन्धित क्षेत्र, जसमा कोशिका प्रसारलाई उत्तेजित गर्ने उच्चतम क्षमता थियो (चित्र 3j) मा ओभरप्रेस गरिएको थियो।यी परिणामहरूले DARS-AS1 को बाध्यकारी क्षमता र जैविक प्रकार्य बीचको सकारात्मक सम्बन्धलाई संकेत गर्दछ।
PACT एक प्रो-अपोप्टोटिक प्रोटीन 19 भएको रिपोर्ट गरिएको छ।त्यसकारण, हामीले एपोप्टोसिसमा DARS-AS1 को प्रभावको अनुसन्धान गर्‍यौं।अपेक्षित रूपमा, DARS-AS1 नकडाउनले SW620 कक्षहरूमा PARP क्लीभेजलाई उल्लेखनीय रूपमा बढायो र SW620, HCT116, HepG2, र MBA-MD-231 सेल लाइनहरूमा एनेक्सिन V-पोजिटिभ सेलहरूको अनुपात बढ्यो (चित्र 3k)।३)।3f–h), क्यान्सर कोशिकाहरूमा DARS-AS1 को एन्टी-अपोप्टोटिक प्रभाव PACT को एपोप्टोसिस-इन्ड्युसिंग प्रकार्यको विपरीत हो भनेर संकेत गर्दछ।सँगै लिइएको, यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि DARS-AS1 oncogenic प्रकार्यको संयन्त्र PACT प्रकार्यको अवरोध मार्फत हुन सक्छ।
अर्को, हामीले DARS-AS1-PACT संघको कार्यात्मक प्रभावहरू अन्वेषण गर्यौं।PACT लाई प्रत्यक्ष अन्तरक्रिया मार्फत PKR सक्रिय गर्न रिपोर्ट गरिएको छ, जसले पछि eIF2α फास्फोरिलेसनलाई बढाउँछ, जसले अनुवादात्मक मेटाउने र apoptosis17 निम्त्याउँछ।पहिले, हामीले जाँच गर्यौं कि DARS-AS1 ले PACT र PKR को सेलुलर स्थानीयकरणलाई असर गर्छ।कन्फोकल फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपीले देखाएको छ कि PACT र PKR SW620 कोशिकाहरूमा 0.72 को औसत Pearson सहसंबंध गुणांकको साथ अत्यधिक कोलोकलाइज गरिएको थियो।यसैबीच, DARS-AS1 ओभरएक्सप्रेसनले PACT र PKR सह-स्थानीयकरणलाई उल्लेखनीय रूपमा कम गर्यो (मतलब पियर्सन सहसंबंध गुणांक 0.61) (चित्र 4a)।DARS-AS1 ले PACT-PKR अन्तरक्रियालाई परिमार्जन गर्न सक्छ कि भनेर अनुसन्धान गर्न, हामीले SW620 सेल lysates मा एन्टि-PACT एन्टिबडीको साथ सह-इम्युनोप्रेसिपिटेशन (को-आईपी) परख प्रदर्शन गर्यौं।PKR नियन्त्रण कक्षहरूमा एन्टि-PACT मा अत्यधिक समृद्ध थियो, जबकि PKR रिकभरी DARS-AS1 (चित्र 4b) को ओभरएक्सप्रेस गर्ने कोशिकाहरूबाट लिसेट्समा उल्लेखनीय रूपमा कम भएको थियो।शुद्ध लेबल गरिएको PACT र PKR इन भिट्रो प्रोटीन बाध्यकारी assess को लागी प्रयोग गरिएको थियो।तदनुसार, DARS-AS1 प्रदान गर्ने तर कुनै नियन्त्रण आरएनएले दबाएको PACT-PKR अन्तरक्रिया (चित्र 4c) देखायो।सबै परिणामहरूले देखाए कि DARS-AS1 ले PACT र PKR संचारलाई बाधा पुर्‍यायो।
नियन्त्रण कक्षहरूमा PACT र PKR को सह-स्थानीयकरण वा DARS-AS1 ओभरएक्सप्रेस गर्ने कक्षहरू कन्फोकल फ्लोरोसेन्स माइक्रोस्कोपी प्रयोग गरेर अवलोकन गरिएको थियो।नाभिकहरू DAPI ले दाग थिए।तथ्याङ्कीय परिणामहरू 16 तस्बिरहरूबाट प्राप्त गरियो।b Co-immunoprecipitation (co-IP) नियन्त्रण SW620 कोशिकाहरू वा DARS-AS1 को ओभरएक्सप्रेस गर्ने कोशिकाहरूको लाइसेट्समा एन्टि-PACT एन्टिबडी प्रयोग गर्दै।c लेबल गरिएको PACT, शुद्ध PKR र DARS-AS1 वा नक्कली RNA सँग भिट्रोमा ट्रान्सक्रिप्ट गरिएको इन भिट्रो प्रोटीन बाइन्डिङ विश्लेषणको लागि इन्क्युबेटेड थियो।एन्टि-फ्ल्याग एन्टिबडीहरू प्रतिरक्षाको लागि प्रयोग गरियो।d संकेतित एन्टिबडीहरू भएका इम्युनोब्लोट्सहरू SW620 र HCT116 कोशिकाहरूमा कन्ट्रोल shRNA वा DARS-AS1-shRNA पछि सीरम भोकमरीबाट ट्रान्सफेक्ट गरिएका थिए।e DARS-AS1 अभिव्यक्ति स्तरहरूले थाप्सिगार्गिनमा सेलुलर संवेदनशीलतालाई परिवर्तन गर्यो।SW620 कोशिकाहरू DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression प्लाज्मिड वा कन्ट्रोल प्लाज्मिडबाट ट्रान्सफेक्ट गरिएको थियो।कोशिकाहरूलाई 48 घण्टासम्म थाप्सिगार्गिनद्वारा उपचार गरिएको थियो र MTS अभिकर्मक प्रयोग गरेर सेल व्यवहार्यता निर्धारण गरिएको थियो।f इन भिट्रो ट्रान्सक्रिप्टेड DARS-AS1 वा डमी RNA र शुद्ध PACT इन भिट्रो सक्रियता परख र इम्युनोब्लोट पत्ता लगाउन प्रयोग गरियो।g यी एन्टिबडीहरू प्रयोग गरेर इम्युनोब्लोटहरू SW620-ctrl कोशिकाहरू (बायाँ) वा PKR म्युटेन्टहरू (दायाँ) ओभरएक्सप्रेस गर्ने कक्षहरूमा प्रदर्शन गरियो।यी कोशिकाहरूलाई त्यसपछि कन्ट्रोल shRNA वा DARS-AS1-shRNA सँग ट्रान्सफेक्ट गरियो र त्यसपछि सीरम भोकमरी भयो।h फ्लो साइटोमेट्रीले देखायो कि उत्परिवर्ती PKR को निष्क्रियता SW620 कोशिकाहरूमा DARS-AS1-प्रेरित एपोप्टोसिसको लागि क्षतिपूर्ति भयो।i संकेतित एन्टिबडीहरू सहितको इम्युनोब्लोट्स SW620 (बायाँ) वा HCT116 (दायाँ) कोषहरूमा प्रदर्शन गरिएको थियो।नियन्त्रण shRNA वा DARS-AS1 shRNA बाट ट्रान्सफेक्ट गरिएका कोशिकाहरू सीरम-वञ्चित हुन्छन् र 100 nM PKR C16 अवरोधक वा DMSO सँग पूरक हुन्छन्।स्केल बार = 5 µm।देखाइएको डेटा तीन प्रयोगहरूको औसत ± मानक विचलन हो।* p ≤ ०.०५ दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी-टेस्ट।
यो सामान्यतया विश्वास गरिन्छ कि एक पटक PACT PKR17 सँग अन्तर्क्रिया गरेपछि, Thr451 मा PKR फास्फोरिलेसन प्रेरित गर्न सकिन्छ।हाम्रो परिणामहरूले संकेत गर्यो कि पीकेआर फस्फोरिलेसनको स्तर सीरम भोकमरी पछि DARS-AS1 नकडाउन कोशिकाहरूमा उल्लेखनीय रूपमा बढेको थियो (चित्र 4d र पूरक चित्र। 4a)।तदनुसार, हामीले फेला पार्यौं कि eIF2α को फास्फोरिलेसन, मुख्य PKR सब्सट्रेट, DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d र पूरक Fig. 4a) द्वारा पनि उल्लेखनीय रूपमा वृद्धि भएको थियो।थाप्सिगार्गिन एक ER तनाव हो जसले ER लाई Ca2+ रिलीज गर्छ।थाप्सिगार्गिनसँगको उपचारले PACT को अभिव्यक्ति र सक्रियतालाई प्रेरित गर्ने रिपोर्ट गरिएको छ, जसले PKR सँग थप अन्तरक्रिया गर्छ र सक्रिय गर्दछ, जसले eIF2α फास्फोरिलेसन 18,61 बढाएर एपोप्टोसिस निम्त्याउँछ।यहाँ, हामीले DARS-AS1 ले PACT/PKR मार्गलाई रोकेर कोशिकाहरूलाई तनाव हटाउन मद्दत गर्न सक्छ कि भनेर अनुसन्धान गर्न PACT/PKR मार्गको उत्तेजकको रूपमा थाप्सिगार्गिन प्रयोग गर्यौं।हामीले देख्यौं कि DARS-AS1 अभिव्यक्तिको स्तर सकारात्मक रूपमा थाप्सिगार्गिनको सेल प्रतिरोधसँग सम्बन्धित छ।DARS-AS1 ओभरएक्सप्रेस गर्ने SW620 कोशिकाहरू थाप्सिगार्गिनसँग उपचार गर्दा राम्रोसँग बाँचे, जबकि DARS-AS1 नकडाउन भएका कोशिकाहरू बढी संवेदनशील भए (चित्र 4e)।यी नतिजाहरूसँग अनुरूप, DARS-AS1 ओभरएक्सप्रेसनले थाप्सिगार्गिन-प्रेरित PKR फास्फोरिलेसन (पूरक चित्र 4b) कम गर्यो।यसको विपरित, थाप्सिगार्गिन उपचार पछि, PKR र eIF2α नियन्त्रण कक्षहरूको तुलनामा DARS-AS1 नकडाउन कोशिकाहरूमा उच्च मात्रामा फस्फोरिलेटेड थिए (पूरक चित्र। 4b)।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, थाप्सिगार्गिनले डोज-आश्रित तरिकामा DARS-AS1 अभिव्यक्तिलाई प्रेरित गर्‍यो, जसले DARS-AS1 (पूरक चित्र 4c) को एन्टि-स्ट्रेस प्रकार्यलाई संकेत गर्न सक्छ।थप रूपमा, हामीले यी अवलोकनहरू पुष्टि गर्नको लागि भिट्रो सक्रियता assess मा प्रदर्शन गर्यौं।छोटकरीमा, PKR लाई एन्टी-PKR एन्टिबडी प्रयोग गरेर सेल लाइसेट्सबाट शुद्ध गरिएको थियो, त्यसपछि पुन: संयोजक PACT र DARS-AS1 भिट्रोमा ट्रान्सक्राइब गरिएको थियो।इन्जाइमेटिक प्रतिक्रिया पछि, phospho-PKR WB प्रयोग गरेर पत्ता लगाइएको थियो।हाम्रो नतिजाहरूले संकेत गरे कि PKR फास्फोरिलेसन DARS-AS1 द्वारा उल्लेखनीय रूपमा रोकिएको थियो, तर नियन्त्रण आरएनए (चित्र 4f) द्वारा होइन।यी इन भिट्रो र इन भिभो परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि DARS-AS1 ले PACT-मध्यस्थता PKR सक्रियतालाई रोक्छ।एकै समयमा, हामीले DARS-AS1 (चित्र 4f) को उपस्थितिमा PACT रिकभरीमा कमी पनि देख्यौं।यो परिणाम इन भिट्रो प्रोटीन बाइन्डिंग परख (चित्र 4c) को नतिजा संग संगत छ र फेरि PACT-PKR एसोसिएशन को लागी DARS-AS1 को अवरुद्ध प्रकार्य को चित्रण गर्दछ।
सेलुलर तनाव अन्तर्गत PKR सक्रियताको लागि PACT को D3 डोमेनमा Ser246 र Ser287 आवश्यक छ।एलानाइनका लागि दुई सेरिन अवशेषहरूको प्रतिस्थापनले उत्परिवर्ती PACT (mutD) दियो, जसले तनावको अभावमा PKR सक्रिय गर्‍यो, र एलानाइन (mutA) को प्रतिस्थापनले प्रोटोकललाई उल्ट्यायो।हामीले DARS-AS1 सँग प्रत्यक्ष सम्बन्धमा यस डोमेनको महत्त्व देखाएको हुनाले, यी अवशेषहरू DARS-AS1 सँग अन्तरक्रियामा संलग्न हुन सक्छन् कि भनेर परीक्षण गर्न हामीले यी दुई PACT म्युटेन्टहरू उत्पन्न गरेका छौं।चाखलाग्दो कुरा के छ भने, दुबै उत्परिवर्तीहरूले DARS-AS1 (पूरक चित्र 4d) मा बाँध्ने क्षमता गुमाए, DARS-AS1 सँग प्रभावकारी अन्तरक्रियाको लागि PACT प्रोटीनको पूर्ण संरचना आवश्यक हुन सक्छ भन्ने सुझाव दिन्छ।
यसबाहेक, हाम्रा नतिजाहरूले यो पनि सुझाव दिन्छ कि DARS-AS1-shRNA-प्रेरित सेल प्रसारको अवरोधलाई प्रभावशाली नकारात्मक PACT mutant (PACTmutA) वा प्रमुख नकारात्मक PKR उत्परिवर्ती (PKRmut) (पूरक चित्र 4e. e) को ओभरएक्सप्रेस गरेर आंशिक रूपमा पुनर्स्थापित गर्न सकिन्छ।प्रभावशाली-नकारात्मक PKR म्युटेन्टहरूको ओभरएक्सप्रेसनले DARS-AS1 नकडाउनको साथसाथै सीरम-वञ्चित कोशिकाहरूमा eIF2α फास्फोरिलेसन (चित्र 4g) द्वारा प्रेरित PKR फास्फोरिलेसन कम गर्‍यो।अझ महत्त्वपूर्ण कुरा, DARS-AS1 नकडाउन द्वारा प्रेरित एपोप्टोटिक कोशिकाहरूको अनुपात पनि PKRmut (चित्र 4h र पूरक चित्र 4g) ओभरएक्सप्रेस गर्ने कक्षहरूमा घटाइएको थियो।PKR kinase गतिविधिको अवरोधले DARS-AS1 प्रकार्यलाई पनि बाधा पुर्‍याउँछ, परिणामहरूले देखाए कि DARS-AS1 नकडाउनले PKR र eIF2α फास्फोरिलेसनलाई विरलै ट्रिगर गर्‍यो जब कोशिकाहरूलाई PKR-विशिष्ट C16 अवरोधक (चित्र 4i र सप्लिमेन्टरी फिग 4) सँग उपचार गरिएको थियो।)।सँगै लिइएको, हाम्रो परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि DARS-AS1 ले सेल प्रसारलाई बढावा दिन्छ, कम्तिमा आंशिक रूपमा, PACT- मध्यस्थता PKR सक्रियतालाई रोकेर।
tumorigenesis मा DARS-AS1 को भूमिका थप अन्वेषण गर्न, हामीले माउस xenograft मोडेल प्रयोग गरेर vivo प्रयोगहरूमा प्रदर्शन गर्यौं। नतिजाहरूले देखाउँछन् कि DARS-AS1 को नकडाउनले नाटकीय रूपमा मुसाहरूमा ट्युमर वृद्धि घटाएको छ (p मान <0.0001) (चित्र 5a)। नतिजाहरूले देखाउँछन् कि DARS-AS1 को नकडाउनले नाटकीय रूपमा मुसाहरूमा ट्युमर वृद्धि घटाएको छ (p मान <0.0001) (चित्र 5a)। Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (RIS. 5a)। नतिजाहरूले देखाउँछन् कि DARS-AS1 नकडाउनले मुसाहरूमा ट्युमरको वृद्धिलाई एकदमै कम गर्छ (p मान <0.0001) (चित्र 5a)।结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）।结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）। Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (RIS. 5a)। नतिजाहरूले देखाए कि DARS-AS1 नकडाउनले मुसाहरूमा ट्युमरको वृद्धिलाई उल्लेखनीय रूपमा घटाएको छ (p मान <0.0001) (चित्र 5a)।यसरी, DARS-AS1 नकडाउन समूहमा, लगभग 72.9% द्वारा ट्यूमरको मात्रा र 87.8% (चित्र 5b-d) मा ट्युमरको मात्रामा उल्लेखनीय कमी आएको थियो।यी परिणामहरूले दृढतापूर्वक सुझाव दिन्छ कि DARS-AS1 ले vivo मा ट्युमर वृद्धिलाई महत्त्वपूर्ण रूपमा बढावा दिन सक्छ।
नग्न मुसाहरूमा कोलोरेक्टल ओन्कोजेनेसिसमा विज्ञापन DARS-AS1 नकडाउनको प्रभावहरू।ग्रोथ कर्भ (a), ट्यूमर साइज (b), वजन (c), र ट्यूमर छविहरू (d) देखाइएको छ।त्रुटि पट्टीहरूले ± SEM प्रतिनिधित्व गर्दछ। n = 10। ****p < 0.0001, दुई पुच्छर विद्यार्थीको t परीक्षण द्वारा। n = 10। ****p < 0.0001, दुई पुच्छर विद्यार्थीको t परीक्षण द्वारा। n = 10। ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента। n = 10। ****p < 0.0001 दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी-टेस्ट।n = १०। ****p <0.0001, 通过双尾学生t 检验। ****p <0.0001, 通过双尾学生t检验। ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента। ****p <0.0001 दुई पुच्छर विद्यार्थीको टी-परीक्षा।e Kaplan-Meier ले DARS-AS1 अभिव्यक्ति स्तरहरू र UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, र LGG भएका बिरामीहरूमा समग्र बाँच्ने बीचको सम्बन्धको विश्लेषण गर्नुभयो।बिरामीहरूमा DARS-AS1 अभिव्यक्तिको उच्च स्तर शीर्ष 50% मा थिए;बिरामीहरूमा DARS-AS1 अभिव्यक्तिको निम्न स्तर तल 50% मा थियो।p-मानहरू लग श्रेणी परीक्षण प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।f प्रस्तावित मोडेल जसमा DARS-AS1 ले PACT-PKR मार्ग र ट्युमर वृद्धिलाई नियमन गर्दछ।
DARS-AS1 को नैदानिक ​​​​प्रभावलाई अझ राम्रोसँग बुझ्नको लागि, हामीले यसको अभिव्यक्ति र बिरामीको अस्तित्व बीचको सम्बन्धलाई जाँच्यौं।TCGA डाटासेटको विश्लेषण गरेर, हामीले फेला पार्यौं कि उच्च DARS-AS1 अभिव्यक्ति uveal melanoma (UVM), रेनल क्रोमोफोबिया (KICH), रेनल प्यापिलरी सेल कार्सिनोमा (KIRP), मेसोथेलियोमा (MESO), मल्टिप्लेक्ससँग सम्बन्धित थियो।ग्लियोब्लास्टोमा मोर्फोसिस (GBM) र न्यून-ग्रेड ब्रेन ग्लियोमा (LGG) (चित्र 5e) भएका बिरामीहरूसँग तल्लो बाँच्न महत्त्वपूर्ण रूपमा सम्बन्धित थियो।यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि DARS-AS1 क्लिनिकल ट्यूमर प्रगतिमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्न सक्छ र बहुविध क्यान्सरहरूमा सम्भावित भविष्यवाणी बायोमार्कर हुन सक्छ।
यस अध्ययनमा, ठूलो मात्रामा CRISPRi कार्यात्मक स्क्रीनिंग प्रयोग गरेर, हामीले निर्धारण गर्यौं कि DARS-AS1 lncRNA ले दुई प्रमुख तनाव प्रतिक्रियाकर्ताहरू, PACT र PKR लाई विनियमित गरेर क्यान्सर सेल तनावलाई जित्छ।PACT सँग सीधा अन्तरक्रिया गरेर, DARS-AS1 ले PACT-मध्यस्थता PKR सक्रियतालाई रोक्छ, जसले गर्दा एपोप्टोटिक कोशिकाको मृत्युलाई रोक्छ र कोशिका विस्तारलाई बढावा दिन्छ (चित्र 5f)।DARS-AS1 को अपरेग्युलेसन धेरै प्रकारका क्यान्सरहरूमा अवलोकन गरिएको छ, यसले सुझाव दिन्छ कि तनावपूर्ण अवस्थाहरूमा क्यान्सर कोशिकाको अस्तित्वलाई बढावा दिने कार्य धेरै प्रकारका क्यान्सरहरूमा व्यापक रूपमा लागू हुन सक्छ।
PACT लाई PKR एक्टिभेटर प्रोटीनको रूपमा पहिचान गरिएको छ, र PACT-मध्यस्थता PKR सक्रियताले ट्रान्सक्रिप्शन, अनुवाद, एपोप्टोसिस, र अन्य महत्त्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाहरू विनियमित गरेर तनाव प्रतिक्रियाहरूमा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ।दशकौंदेखि, PACT-PKR क्यास्केडको क्यान्सर-विशिष्ट नियमनलाई बुझ्ने प्रयास गरिएको छ।यहाँ, हाम्रो अध्ययनले सेलुलर lncRNA DARS-AS1 मार्फत क्यान्सर कोशिकाहरूमा PACT-PKR को नियमन गर्ने फरक संयन्त्र प्रकट गर्‍यो, जसले प्रत्यक्ष रूपमा PACT मा बाँध्छ, PACT-PKR अन्तरक्रियालाई रोक्छ, PKR सक्रियता र eIF2α फास्फोरिलेसनलाई रोक्छ, जसले गर्दा तनाव-प्रेरित apoptosis रोक्छ। अन्ततः क्यान्सर प्रसार को उत्तेजित।कक्षहरू।यो खोजले क्यान्सर रोगको निदान र उपचारका लागि सम्भावित lncRNA लक्ष्यहरूमा प्रकाश पार्छ।
हाम्रो डेटाले देखायो कि DARS-AS1 नकडाउनले फोस्फोरिलेटेड PKR र eIF2α मा उल्लेखनीय वृद्धिको साथ सीरम भोकमरीमा सेलहरूलाई संवेदनशील बनाउँछ।यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छ कि DARS-AS1 ले PACT/PKR गतिविधिलाई रोकेर कठोर परिस्थितिहरूमा क्यान्सर कोषको अस्तित्वलाई बढावा दिन्छ।धेरै अन्य गैर-कोडिङ RNAs, जस्तै ASPACT र nc886, PACT48 mRNA लाई डाउनरेगुलेट गरेर वा PKR49,50,64 मा बाध्य भएर autophosphorylation को नियमन गरेर PACT/PKR अक्षमा संलग्न छन्।ती मध्ये, DARS-AS1 ले PACT-PKR एसोसिएशनको अवरोधकको रूपमा कार्य गर्दछ।यस अध्ययनले PACT/PKR अक्ष नियमन र तनाव प्रतिक्रियाहरूमा lncRNAs को भूमिकाको हाम्रो बुझाइलाई समृद्ध बनाउँछ।
PACT मा तीन अलग-अलग डोमेनहरू छन्।पहिलो दुई dsRBDs मध्ये प्रत्येक PACT को PKR मा उच्च आत्मीयता बाइन्डिङ हासिल गर्न पर्याप्त छ, जबकि तेस्रो डोमेन (D3) भिट्रो र भिभोमा PKR सक्रियताको लागि आवश्यक छ।हाम्रो अध्ययनले देखायो कि DARS-AS1 ले D3 डोमेन (चित्र 3h) सँग अन्तरक्रिया गर्दछ।lncRNA (768 nucleotides) को ठूलो आकारलाई दिईयो, DARS-AS1 D3 लाई बन्धनले शारीरिक रूपमा dsRBD र PKR को PACT डोमेन बीचको अन्तरक्रियालाई रोक्न सक्छ, जसले PACT र PKR को सम्बन्धलाई रोक्छ।PACT पोइन्ट उत्परिवर्तन जसले Ser246 र Ser287 लाई D3 मा alanine वा aspartate ले प्रतिस्थापन गर्‍यो, यसले DARS-AS1 को लागि यसको बाध्यकारी आत्मीयतालाई बाधा पुर्‍यायो, तिनीहरूको सम्बन्धमा D3 को समग्र संरचनात्मक र विद्युतीय गुणहरूको महत्त्वलाई औंल्याउँदै।यस संयन्त्रको थप विवरणहरू भविष्यमा आवश्यक पर्नेछ, थप सटीक बायोकेमिकल विश्लेषण र उच्च रिजोलुसन PACT संरचनात्मक विश्लेषण प्रयोग गरेर।
अघिल्लो अध्ययनहरूले रिपोर्ट गरेको छ कि DARS-AS1 ले धेरै संयन्त्रहरू 51,52,53 मार्फत सेल प्रसारलाई बढावा दिन्छ।एउटा उदाहरणमा, अन्वेषकहरूले अवलोकन गरे कि DARS-AS1 ले मिर्गौलाको क्यान्सर कोशिकाहरूमा miP-194-5p लाई लक्षित गरेर यसको एन्टिसेन्स प्रोटीन-इन्कोडिङ DARS जीनलाई अपरेगुलेट गरेको छ।यद्यपि, हालको अध्ययनमा, DARS-AS1 नकडाउनले कम्तिमा कोलोरेक्टल, स्तन र कलेजोको क्यान्सरहरू सहित धेरै प्रकारका क्यान्सरहरूमा DARS ट्रान्सक्रिप्शनमा कम प्रभाव पारेको थियो।किनभने lncRNAs ले सेल- र टिश्यु-विशिष्ट अभिव्यक्ति ढाँचाहरू प्रदर्शन गर्दछ, कार्यात्मक संयन्त्रहरू क्यान्सर प्रकारहरूमा संरक्षित नहुन सक्छ, जसले हाम्रो अवलोकनहरू र विभिन्न क्यान्सरहरूको अघिल्लो मूल्याङ्कनहरू बीचको यो भिन्नतामा योगदान गर्न सक्छ।विभिन्न शारीरिक र रोगविज्ञान प्रक्रियाहरूको विशिष्ट संयन्त्रहरू स्पष्ट गर्न विशेष अध्ययनहरू आवश्यक छन्।
क्लिनिकल डेटाको विश्लेषणले देखायो कि ट्यूमरहरूमा DARS-AS1 अभिव्यक्ति उल्टो रूपमा क्यान्सर रोगीहरूको अस्तित्वसँग सम्बन्धित छ, जसले क्यान्सर रोगको निदानमा DARS-AS1/PACT/PKR अक्षको महत्त्वलाई रेखांकित गर्दछ।अन्तमा, हाम्रो अध्ययनले देखाउँछ कि DARS-AS1 PACT/PKR सिग्नलिङ अक्षको नियामक हो, क्यान्सर सेल प्रवर्द्धनलाई बढावा दिन्छ, र तनाव प्रतिक्रियाको समयमा एपोप्टोसिसलाई रोक्छ, जसले अनुसन्धानको अर्को लाइन प्रदान गर्दछ र सम्भावित उपचारहरूमा भविष्यको अनुसन्धानको लागि चासोको विषय हो। ।
मानव सेल लाइनहरू SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 र HEK293T चीनको राष्ट्रिय सेल लाइन रिसोर्स इन्फ्रास्ट्रक्चरबाट प्राप्त गरियो।सबै कक्षहरू DMEM माध्यम (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) मा 10% FBS (जेमिनी, ब्रुकलिन, NY) र 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (थर्मो फिशर वैज्ञानिक) 37°C, 5% CO2 सँग पूरक राखिएको थियो।इन्क्यूबेटर।
विरोधी PACT, Abcam (ab31967);विरोधी PKR, Abcam (ab184257);एन्टि-पीकेआर (फस्फो-टी४५१), एबक्याम (एबी८१३०३);विरोधी झण्डा, Abcam (ab125243);विरोधी eIF2α, Abcam (A0764));विरोधी eIF2α (फस्फोरस S51), Abcam (ab32157);विरोधी PACT (फस्फोरस S246), Abgent (AP7744b);एन्टी-बीटा-ट्यूब्युलिन, CST (2128);सामान्य माउस IgG, CST (5415S);सामान्य खरायो IgG, CST (2729S)।एन्टिबडीहरू पश्चिमी ब्लोटिंगको लागि PBST मा 1:1000 र IP को लागि 1:100 पातलो गरियो।
sgRNAs CRISPR-ERA66 भनिने सार्वजनिक रूपमा उपलब्ध उपकरण प्रयोग गरेर विकास गरिएको थियो।हामीले sgRNA विकासका लागि पूर्वनिर्धारित उपकरण प्यारामिटरहरू प्रयोग गर्यौं र 3 kb क्षेत्रमा एल्गोरिदम कम्प्युटेड sgRNA बाइन्डिङ साइटहरू।TSS मा केन्द्रित।sgRNA oligonucleotides को पूल CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) मा संश्लेषित गरियो र मानवीकृत pgRNA प्लाज्मिड (Addgene #44248) मा क्लोन गरियो।कुल 12 µg पूल गरिएको मानवीकृत pgRNA प्लाज्मिड, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), र 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) लाई 5 x 106 HEK106 HEKsfection HEK293T डिसफेक्टमा प्रयोग गरी सह-संक्रमण गरिएको थियो। सेलहरू (CWBIO, बेइजिङ, चीन) निर्माताको निर्देशनहरू पछ्याउँदै।भाइरस युक्त सुपरनेटेन्टहरू ट्रान्सफेक्सनको ४८ र ७२ घण्टापछि सङ्कलन गरी ०.४५ माइक्रोन फिल्टर मार्फत फिल्टर गरिएको थियो।स्क्रिनिङको लागि, dCas9/KRAB फ्युजन प्रोटीन व्यक्त गर्ने SW620 कोशिकाहरू भाइरस ट्रान्सडक्सनद्वारा प्राप्त गरिएका थिए।परिमार्जित SW620 कोशिकाहरू 0.1-0.3 को MOI मा चार स्वतन्त्र संक्रमण प्रयोगहरूमा भाइरस पुस्तकालयबाट संक्रमित थिए र 2 दिनको लागि 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) सँग नमूना गरिएको थियो।त्यसपछि, स्क्रिनिङको लागि न्यूनतम 500 कोशिकाहरू/sgRNA को पुस्तकालय कभरेजको साथ भिट्रोमा 18 दिनको लागि सेलहरू कल्चर गरियो।
जीनोमिक डीएनए QIAamp DNA ब्लड मिडी किट (QIAGEN, Düsseldorf, जर्मनी; 51183) को निर्देशन अनुसार निकालिएको थियो।कुलमा, पुस्तकालय निर्माण गर्न प्रति जैविक दोहोरिने 100 μg जीनोमिक डीएनए प्रयोग गरिएको थियो।sgRNA क्षेत्रलाई PCR को दुई राउन्डद्वारा विस्तार गरिएको थियो र बारकोडसँग जोडिएको थियो।
PCR उत्पादनहरू NucleoSpin® जेल र PCR शुद्धिकरण किट (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) को प्रयोग गरेर शुद्ध गरियो र Qubit™ HS डबल-स्ट्र्यान्ड DNA पत्ता लगाउने किट (थर्मो फिशर वैज्ञानिक; Q32854) को प्रयोग गरेर परिमाण निर्धारण गरियो।
MTS परख सेल प्रसार मापन गर्न प्रयोग गरिएको थियो।कक्षहरू 2000 कोशिकाहरू/कुवाको प्रारम्भिक घनत्वमा 96-कुवा प्लेटहरूमा सीड गरिएको थियो।कक्षहरूको सापेक्ष संख्या कुल 4-6 दिनको लागि संकेत गरिएको समयमा दैनिक मापन गरिएको थियो।प्रत्येक इनारको लागि, एमटीएस अभिकर्मक (प्रोमेगा) को 20 μl 100 μl DMEM सँग पातलो गरिएको थियो, 37 डिग्री सेल्सियसमा 4 घन्टाको लागि कोशिकाहरूसँग इन्क्युबेटेड, र त्यसपछि OD490 मापन गरियो।
गोलाकारहरूको गठनको विश्लेषण गरेर अनाङ्कर गरिएको वृद्धिको क्षमता पत्ता लगाइएको थियो।छोटकरीमा, shRNA DARS-AS1 वा नियन्त्रण shRNA बाट ट्रान्सफेक्ट गरिएका 2000 कोशिकाहरूलाई प्रत्येक 4 दिनमा मध्यम परिवर्तनको साथ अल्ट्रा लो एट्याचमेन्ट माइक्रोप्लेट (कोर्निङ) मा कल्चर गरिएको थियो।स्फेरोइडहरू 14 दिन पछि गणना गरियो।DARS-AS1 ओभरएक्सप्रेसन प्लाज्मिड वा कन्ट्रोल प्लाज्मिडसँग ट्रान्सफेक्ट गरिएका 500 कोशिकाहरू एन्हान्समेन्ट परखका लागि प्रयोग गरियो, अन्यथा विधि अपरिवर्तित थियो।
RNA T7 RNA पोलिमेरेज र बायोटिन-16-UTP (Roche 1138908910) को प्रयोग गरेर Riboprobe® संयोजन प्रणाली (Promega P1440) को निर्देशन अनुसार ट्रान्सक्राइब गरिएको थियो।यहाँ प्रयोग गरिएका प्राइमरहरू पूरक तालिका 4 मा सूचीबद्ध छन्।
प्रोटीन-कोडिङ PACT वा PKR क्षेत्रहरूलाई pET15b (Addgene #73619) मा क्लोन गरियो र BL21 (DE3) मा रूपान्तरण गरियो।ब्याक्टेरियाहरू रातभर एम्पिसिलिनसँग आपूर्ति गरिएको एलबीमा इन्क्युबेटेड थिए र त्यसपछि ताजा एलबीसँग 100-गुणा पतला हुन्छन्।जब माध्यमको OD600 0.8 पुग्यो, 1 mM IPTG प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित गर्न थपियो।कोमल हल्लाउने (20°C मा 250 rpm) को साथ रातभर इन्क्युबेशन पछि, सेल गोली सेन्ट्रीफ्यूगेशन (4000 rpm, 10 मिनेट, 4°C) द्वारा सङ्कलन गरिएको थियो।सेल गोली लाई लाइसिस बफर (50 एमएम Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) मा पुन: सस्पेन्ड गर्नुहोस् र 30 मिनेटको लागि बरफमा इन्क्युबेट गर्नुहोस्, त्यसपछि सोनिकेट (15 मिनेट, 5 सेकेन्ड अन/अफ, बरफमा) र सेन्ट्रीफ्यूज (1300,000)। rpm)।, ३० मिनेट, ४°से.)त्यसपछि सुपरनेटेन्टलाई Ni-NTA राल (QIAGEN) मा ३ पटक ४ डिग्री सेल्सियसमा लोड गरियो, ४ पटक धुने बफर (५० एमएम ट्रिस, पीएच ८.०, ४० एमएम इमिडाजोल, २५० एमएम NaCl) र कुल ३ पटक एल्युट गरियो। 10 ml eluent बफर (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole)।शुद्ध प्रोटीन WB प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो र एकाग्रता Qubit™ प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर वैज्ञानिक; Q 33212) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।
RIP assays परिमार्जन संग, पहिले वर्णन गरिए अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो।संक्षिप्तमा, 1x RIP बफर (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime बायोटेक्नोलजी), 1 mM DDM, protease10stack010000 एमएम (Roche, 1 mM DTT) र 13,000 rpm मा 4 °C मा 15 मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्यूज।सुपरनेटेन्टलाई त्यसपछि प्रोटीन A+G चुम्बकीय मोती (मिलीपोर) 5 μg एन्टि-PACT एन्टिबडी (Abeam) वा IgG (CST) संग संयुग्मित गरिएको थियो।मोतीहरू 5x RIP बफरसँग 5 पटक धोइयो, त्यसपछि प्रोटीनेज K (NEB) ले पचाइयो।RNA Trizol को साथ निकालिएको थियो र RT-qPCR द्वारा निर्धारण गरिएको थियो।प्राइमरहरू पूरक तालिका 5 मा प्रस्तुत गरिएका छन्।
इन भिट्रो RIP परख परिमार्जित मानक RIP परख प्रोटोकल अनुसार प्रदर्शन गरिएको थियो।इन भिट्रो ट्रान्सक्राइब गरिएको RNA को कुल 5 pmol RIP बफरसँग 1x पातलो गरियो र 5 मिनेटको लागि 65°C मा इन्क्युबेशनद्वारा एनेल गरियो र त्यसपछि कोठाको तापक्रममा ढिलो चिसो हुन्छ।कुल 5 pmol अक्षुण्ण वा उत्परिवर्तित झण्डा-लेबल PACT प्रोटिनहरू ई. कोलाईबाट शुद्ध गरियो।4°C मा 2 घण्टाको लागि पुनर्निर्मित RNA संग इन्क्युबट गर्नुहोस् र एन्टी-फ्ल्याग IP को लागि RIP विश्लेषणको लागि माथिको प्रक्रिया पालना गर्नुहोस्।
आरएनए विस्तार विश्लेषणको लागि, 1xRIP बफरसँग 1x107 कक्षहरू लिइयो।4°C मा 15 मिनेटको लागि 13,000 rpm मा सेन्ट्रीफ्युगेशन पछि, 4°C मा 2 घन्टाको लागि 30 μl स्ट्रेप्टाभिडिन चुम्बकीय मोती (बेकम्यान) द्वारा सुपरनेटेन्टलाई प्रिटिटेड गरियो।प्युरिफाइड लाइसेटलाई खमीर tRNA संग आपूर्ति गरियो र 40 pmol renatured RNA को रातभर 4°C मा इन्क्युबेटेड गरियो, त्यसपछि अर्को 2 घण्टा र BSA सँग ब्लक गरिएको नयाँ स्ट्रेप्टाभिडिन चुम्बकीय मोतीको 20 μl थपियो।धुने चरण 5x RIP बफर संग 4 पटक र 1x RIP बफर संग 4 पटक सम्मिलित थियो।सम्बन्धित प्रोटीनहरू बायोटिन इल्युसन बफर (25 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 12.5 एमएम डी-बायोटिन, पीएमएसएफ) बाट हटाइयो र NuPAGE 4-12% Bis-Tris जेल (इनभिट्रोजन) मा अलग गरियो।चाँदीको दाग (बियोटाइम बायोटेक्नोलोजी) पछि, एमएस द्वारा निश्चित ब्यान्डहरू एक्साइज र विश्लेषण गरियो।
PACT र PKR बीचको अन्तरक्रिया परीक्षण गर्न को-आईपी विश्लेषण गरिएको थियो।छोटकरीमा, 1 x RIP बफरमा 1 x 107 lysed कोशिकाहरूलाई इन्क्युबट गरेर, 13,000 rpm मा 4°C मा 15 मिनेटको लागि सेन्ट्रीफ्युगेशनद्वारा सुपरनेटान्ट लाइसेट्स तयार गरिएको थियो।Lysates प्रोटीन A + G चुम्बकीय मोतीले भरिएको थियो, 5 µg एन्टि-PACT एन्टिबडीसँग संयुग्मित, र बिस्तारै रातभर 4 डिग्री सेल्सियसमा घुमाइयो।मोतीहरू 5×RIP बफरसँग 3 पटक धोइयो, 1×RIP बफरसँग दुई पटक र 1×SDS बफरद्वारा इल्युट गरियो।बरामद प्रोटीन SDS-PAGE जेल द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो र WB द्वारा पत्ता लगाइएको थियो।
फ्ल्याग गरिएको PACT को दुई pmol र PKR को 1 pmol E. coli बाट शुद्ध गरिएको थियो।1× RIP बफरमा पातलो पार्नुहोस् र 10 pmol renatured RNA को 4 डिग्री सेल्सियसमा २ घण्टाको लागि इन्क्युबेट गर्नुहोस्।त्यस पछि, उनीहरूलाई थप दुई घण्टाको लागि प्रोटीन A+G चुम्बकीय मनका-कन्जुगेटेड एन्टि-लेबल एन्टिबडीसँग इन्क्युबेटेड गरियो।त्यसपछि मोतीहरू 1x RIP बफरसँग चार पटक धोइयो र 1x SDS बफरको साथ एल्युट गरियो।परिणामस्वरूप PACT र PKR WB द्वारा पत्ता लगाइएको थियो।